大蒜总黄酮的超声波辅助提取及其抗氧化活性*

李利华

(陕西理工学院 化学与环境科学学院，陕西 汉中，723000)

大蒜中含有芹菜定、异鼠李黄素、山奈酚、槲皮素等6 种黄酮类化合物(flavonoids)［1］。黄酮类化合物又名生物类黄酮，属植物次级代谢产物，广泛存在于蔬菜、水果及谷物中，具有抗菌、抗病毒、消炎、抗过敏、扩张血管等多种生理功能，还具有很好的清除自由基、抗氧化活性［2-4］。本研究采用超声波辅助乙醇提取大蒜中的黄酮类化合物，通过单因素和正交实验设计对其总黄酮的提取工艺条件进行优化;并以体外抗氧化体系为模型，研究其对羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O2-·)的清除能力。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

紫皮大蒜，购于汉中蔬菜批发市场，将大蒜剥皮、洗净、切片，50 ℃干燥至恒重，研成细粉末备用。

芦丁标准品(优级纯，购自中国药品生物制品检定所)、无水乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、邻二氮菲、双氧水、FeSO4、Vc、三羟甲基氨基甲烷等均为国产分析纯。

KQ-700VDE 型三频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;UV 型紫外-可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司;RE-52AA 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;TDL-5-A 低速台式离心机，上海安亭科技仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 大蒜总黄酮超声辅助提取工艺

准确称取大蒜干粉样品2.0 g 若干份，固定超声功率为350 W，分别在不同乙醇体积分数、超声提取温度、超声提取时间、料液比条件下提取大蒜黄酮，收集滤液，以石油醚脱脂除色，浓缩并定容于50 mL 容量瓶中，即得大蒜总黄酮提取液。

1.2.2 大蒜总黄酮含量测定及提取率计算

以芦丁为对照品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法［9］制做标准曲线，测定大蒜中总黄酮含量。得到标准曲线方程为:A = 0.941 5 c + 0.014 4，R =0.999 2，芦丁浓度(c)在0.01 ～0.12 mg/mL 内与吸光度(A)有良好的线性关系。

样品含量测定:精密移取大蒜总黄酮提取液1.0 mL 于10 mL 比色管中，加入5% NaNO2溶液0.3 mL，摇匀并放置6 min;加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀并放置6 min;再加入4%NaOH 溶液3 mL，用蒸馏水稀释并定容至刻度，摇匀并放置15 min，在510 nm 处测定吸光度值，根据标准曲线方程计算总黄酮含量及提取率:

1.2.3 单因素试验

以总黄酮提取率为考察指标，通过单因素试验分别研究乙醇体积分数(40%，50%，60%，70%，80%)、超声提取温度(30，40，50，60，70 ℃)、超声提取时间(30，40，50，60，70 min)和料液比(1 ∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60)对大蒜总黄酮提取效果的影响，初步确定适宜提取大蒜总黄酮的相应水平范围。每个处理做3 个平行。

1.2.4 最佳工艺条件优化

根据单因素试验结果，以乙醇体积分数、超声提取温度、超声提取时间及料液比作为4 个考察因素，选取3 个水平，采用L9(34)正交试验设计，优化大蒜总黄酮超声辅助提取的最佳工艺条件。

1.2.5 抗氧化活性的测定

1.2.5.1 对羟自由基(·OH)清除作用的测定

采用邻二氮菲-Fe2+氧化法［6］。10 mL 具塞试管中依次加入5 mmol/L 的邻二氮菲1 mL，pH 7.4 的PBS 缓冲溶液3.8 mL，不同浓度的大蒜总黄酮提取液1.0 mL，5.0 mmol/L 的FeSO41.5 mL 及0.1%H2O21.0 mL，于37℃水浴保温60 min，用紫外分光光度计测536 nm 处吸光度A样品，用蒸馏水代替大蒜总黄酮提取液测定吸光度A损伤，用蒸馏水代替大蒜总黄酮提取液和0.1%H2O2测定吸光度A未损。以Vc 做阳性对照。平行测定3 次。·OH 清除率/% =［(A样品-A损伤)/(A未损-A损伤)］×100

1.2.5.2 对超氧阴离子自由基(O2-·)清除作用的测定

采用邻苯三酚自氧化法［7］。10 mL 具塞试管依次加入0.05 mol/L pH 8.2 的Tris-HCl 缓冲溶液6 mL，不同浓度的大蒜总黄酮提取液1 mL，再加入25℃水浴中预热的邻苯三酚1 mL，摇匀后立即置于25℃水浴准确反应4 min，滴加8 mol/L 的HCl 2 滴终止反应，测320 nm 处吸光度A样品，用蒸馏水代替大蒜总黄酮提取液测定吸光度A空白。以同浓度Vc 做阳性对照，平行测定3 次。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对提取率的影响

由图1 可知，在乙醇体积分数40% ～80%内，总黄酮提取率先随乙醇体积分数的增加而明显增大，乙醇体积分数为60%时达到最高值，后随乙醇体积分数增加而下降。这是由于黄酮是一大类物质，因极性和化学性质的不同导致部分水溶部分醇溶，当乙醇体积分数为60%时，醇溶性和水溶性黄酮类物质都能最大程度地溶出。故选取乙醇体积分数为60%。

2.1.2 超声提取温度对提取率的影响

由图2 可知，在30 ～70 ℃，随着超声提取温度的升高，总黄酮提取率逐渐增大，在60 ℃提取率达最大值，继续升高温度，提取率有所降低。这是由于温度过高，黄酮类化合物结构发生破坏，从而导致提取率下降。故选取超声提取温度60 ℃。

图1 乙醇体积分数对大蒜总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect ofethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

图2 超声提取温度对大蒜总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction yield of total flavonoids

2.1.3 超声提取时间对提取率的影响

由图3 可知，在30 ～70 min 内，总黄酮提取率随着超声提取时间的延长逐渐增大，在50 min 时提取率达最大值，继续延长超声提取时间，提取率反而下降。这是由于长时间超声波处理，非黄酮类物质溶出增加和提取的黄酮发生分解，且时间越长耗能越多。故超声时间应控制在50 min 为宜。

图3 超声提取时间对大蒜总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonicduration on extraction yield of total flavonoids

2.1.4 料液比对提取率的影响

由图4 可知，当料液比为1∶30(g∶mL)时，总黄酮提取率最高，料液比低于1∶30 时提取不完全，高于1∶30 时提取率略呈下降趋势。这是由于料液比为1∶30时，溶剂对黄酮的溶解已基本达到饱和，继续增加溶剂用量，并不能提高其提取率。故料液比应控制在1∶30 为宜。

图4 料液比对大蒜总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect ofratio of material to liquid on extraction yield of total flavonoids

2.2 正交试验设计

根据单因素试验结果选取的正交试验因素水平见表1，按表1 的正交因素水平设计L9(34)正交试验，试验数据经正交助手软件方差统计分析，结果见表2 和表3。

由表2 极差分析可知，各因素对大蒜总黄酮的提取率都有不同程度的影响，各因素对提取率影响的主次顺序为:A(乙醇体积分数)＞B(超声温度)＞C(超声时间)＞D(料液比)，优化得到的最佳提取工艺条件为A2B2C3D2，即乙醇体积分数60%，超声温度60℃，超声时间60 min，料液比1∶30。

表1 L9(34)正交试验因素水平表Table 1 The factors and levels for the L9(34)orthogonal design

由于D (料液比)对提取率影响最小，故其在方差分析表中作为误差项。由表3 可知，4 因素中，A(乙醇体积分数)对总黄酮的提取率有显著性影响。

2.3 最佳工艺验证试验

分别称取5 份大蒜干粉样品，在优化得到的最佳工艺条件(A2B2C3D2)下按照1.2.1 提取大蒜总黄酮并计算提取率，测得总黄酮平均提取率为4.213%，RSD 为1.67%，表明该工艺条件稳定可行，为大蒜总黄酮超声辅助提取的最佳工艺条件。

表2 正交试验结果与分析(n=3)Table 2 Orthogonal array design and results for optimization of the total flavonoids extract (n=3)

表3 正交试验结果方差分析表Table 3 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

2.4 抗氧化活性测定结果

2.4.1 对羟自由基(·OH)清除作用

由图5 看出，随着大蒜总黄酮浓度的增加，其对·OH 的清除率也逐渐增大，且呈现明显的剂量效应关系，在试验范围内的最大清除率为77.56%，对比Vc 可看出，在试验浓度范围内，大蒜总黄酮提取液对·OH 的清除能力强于同浓度的Vc，说明大蒜总黄酮是一种有效的·OH 清除剂。

2.4.2 对超氧阴离子自由基(O2-·)清除作用

由图6 可知，大蒜总黄酮浓度愈高，对O2-·的清除作用愈强，在试验范围最大清除率达87.87%，与Vc 比较可见，试验范围内Vc 对O2-·的最大清除率为95.92%，由此表明大蒜总黄酮对O2-·具有一定的清除作用，清除能力略低于Vc。

3 结论

图5 大蒜总黄酮对羟自由基(·OH)的清除作用Fig.5 Scavenging effect of the total flavonoids extract from garlic on ·OH

图6 大蒜总黄酮对超氧自由基(O2-·)的清除作用Fig.6 Scavenging effect of the total flavonoids extract from garlic on O2-·

(1)实验结果表明，乙醇体积分数对大蒜总黄酮提取率具有显著性影响，各因素对提取率影响的主次顺序为:乙醇体积分数＞超声提取温度＞超声提取时间＞料液比。大蒜总黄酮最佳提取工艺参数为:乙醇体积分数60%，超声温度60 ℃，超声时间60 min，料液比1∶30，在此工艺条件下，大蒜总黄酮的提取率为4.213%。

(2)以Vc 为阳性对照品，研究了大蒜总黄酮的体外抗氧化能力。结果表明，大蒜总黄酮具有一定的清除·OH 和O2-·能力，在一定范围内，清除效果随添加量的升高而加强，且具有明显的量效关系，对·OH 的清除效果要优于同浓度的Vc，而对O2-·的清除效果略低于Vc。

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