吡虫啉分子印迹聚合物的制备及性能表征*

李璐，梁祖培，周绮姗，陈茹，林思良

(华南农业大学食品学院，广东 广州，510640)

吡虫啉是广泛用于茶叶、水稻、棉花等多种农作物病虫害防治的高效、低毒、广谱性杀虫剂，具有一定的细胞毒性和神经毒性，对人体具有一定的致突变和致癌风险，国内外已制订了多种农产品中吡虫啉残留限量标准［1-3］。目前对吡虫啉的检测主要以高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法等为主。由于吡虫啉通常以痕量形式存在于复杂样品中，普遍存在前处理过程繁琐、高毒有机溶剂用量大、富集效果不好等问题。因此探索一种简单高效、选择性强的富集方法具有十分重要的意义。

分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)是一种具有分子识别能力的新型高分子材料，由于它具有预定性、专一性等优点，因此在色谱分离、抗体模拟、固相萃取、生物传感器及模拟酶催化等诸多领域都有广阔的应用前景［4-6］。为此，将对模板分子具有特殊选择性的分子印迹聚合物用于吡虫啉的分离富集引起广泛关注［7-9］。

本研究采用悬浮聚合法制备吡虫啉分子印迹聚合物，采用电镜扫描、静态吸附和固相萃取等方式研究各因素对分子印迹聚合物性能的影响，并用正交实验对合成配方进行优化，研究其特异吸附性能，以寻求一种简单高效的吡虫啉富集和提纯新方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

吡虫啉(陕西苏秦农药厂，纯度95%);乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)(广州双键公司，分析纯);丙烯酸(AA)(天津市福晨化学试剂厂，分析纯);偶氮二异丁腈(AIBN)(天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯);丙酮(衡阳市凯信化工试剂有限公司，分析纯);二氯甲烷(广东光华科技股份有限公司，分析纯);甲醇(上海凌峰化学试剂有限公司，色谱纯);冰乙酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)。

HY-4 调速振荡器(常州澳华仪器有限公司);78-1 磁力加热搅拌器(金坛市富华仪器有限公司);754 紫外-可见分光亮度计(上海菁华科技仪器有限公司);SH 系列鼓风干燥箱(上杭仪器有限公司);HH-S 数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂);增力无极恒速搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司);XL30 环境扫描电子显微镜(荷兰菲利浦电子光学有限公司);57044 型真空固相萃取装置(上海楚定分析仪器有限公司)。

1.2 吡虫啉分子印迹聚合物的制备

采用悬浮聚合法制备吡虫啉分子印迹聚合物。称取适量吡虫啉、8 mmol AA 加入装有适量甲醇的锥形瓶中，置于磁力搅拌器上常温搅拌1 h，使模板分子与功能单体充分作用。然后加入交联剂EGDMA 和50 mg AIBN，继续搅拌10 min，使超分子配合物与交联剂和引发剂充分接触。最后转移到三口烧瓶中，在70 ℃恒温水浴锅内反应24 h，搅拌速度控制在100 ～200 r/min。

对所得悬浊液进行抽滤，用体积分数95 %乙醇和蒸馏水各清洗2 次，70 ℃干燥12 h，然后用丙酮溶液于65 ℃恒温抽提8 h，再用蒸馏水反复清洗聚合物，70 ℃干燥12 h，得到聚合物粉末。

非印迹聚合物(non-imprinted polymers，NIPs)的合成及处理方法除不加入模板分子之外，其余步骤同上。

1.3 分子印迹聚合物的吸附性能

1.3.1 标准曲线的绘制

以二氯甲烷为溶剂，配制浓度为10 ～50 mg/L 的吡虫啉溶液，用紫外分光亮度计在270 nm 波长处测定不同浓度下吡虫啉溶液的吸光度，平行测定3 次，取平均值。从吸光度-浓度曲线图得到吸光度-浓度关系式:y=0.000 6 x，R2=0.995 3。

1.3.2 吡虫啉分子印迹聚合物的静态吸附性能

准确称取100 mg MIPs 微球，置于250 mL 的磨口三角瓶中，加入100 mL 浓度为0.5 g/L 的吡虫啉的二氯甲烷溶液。室温下振荡24 h 后，静置5 min，然后转移到离心管中，3 000 r/min 离心10 min，取上层清液1 mL，用二氯甲烷稀释10 倍，用紫外分光光度计在270 nm 处测定其吸光度，根据标准曲线计算底物的平衡浓度。根据吸附前后底物浓度的变化，由式1 计算出聚合物的平衡吸附量。

其中:Q，静态平衡吸附量(mg/g);cS0，底物的起始浓度(g/L);cS，底物吸附平衡时的浓度(g/L);V，底物溶液的体积(mL);m，MIPs 的质量(g)。

1.4 吡虫啉分子印迹聚合物的固相萃取性能

取100 mg 吡虫啉分子印迹聚合物，干法装柱。先用3 mL 水和3 mL 二氯甲烷对分子印迹固相萃取柱进行活化。然后取适量吡虫啉溶液分上MIPs 柱，控制其流速为1 mL/min。选择体积分数为20%的甲醇-水溶液作为淋洗剂，体积分数为10 %的乙酸-甲醇溶液作为洗脱剂，对固相萃取柱进行淋洗和洗脱，控制其流速为1 mL/min。

收集洗脱液，用紫外分光光度计在270 nm 处测定其吸光度，根据标准曲线计算洗脱液的吡虫啉浓度。根据萃取前后吡虫啉浓度的变化，由式2 计算出吡虫啉溶液的回收率。

其中:cS0，吡虫啉的起始浓度(g/L);cS，吡虫啉洗脱液浓度(g/L)。

1.5 Scatchard 分析

分子印迹研究中一般用Scatchard 模型来评价分子印迹聚合物对模板分子的结合能力以及识别机理，Scatchard 方程表达式如下:

其中:Q，吸附量(mg/g);c，模板在吸附液中的平衡浓度(g/L);Qmax，结合位点的最大表观结合量(mg/g);Kd，结合位点的平衡解离常数(mg/L)。

1.6 吡虫啉分子印迹聚合物的形貌

用XL30 环境扫描电子显微镜观测吡虫啉分子印迹聚合物的形貌和分散度。

2 结果与讨论

2.1 模板分子用量对MIPs 性能的影响

模板分子中所含极性功能基团的数量对形成聚合物的亲和性和选择性有很大影响。分别取吡虫啉2、2.5 和3 mmol，EGDMA 和甲醇用量固定为40 mmol 和100 mL，用1.2 方法制备吡虫啉分子印迹聚合物。模板分子吡虫啉用量对所得MIPs 性能的影响见图1 和图2。

图1 为不同模板分子用量所得MIPs 对不同初始浓度吡虫啉的等温吸附线，由图1 可以看出，不同模板分子用量所得印迹聚合物的平衡吸附量均随底物浓度的增加而增加，在考察范围内，模板分子用量小时，所得聚合物的平衡吸附量较大，这可能是由于当模板分子用量较多时，多余的模板分子会阻碍吸附位点的形成，从而导致吸附量减小。

图1 不同吡虫啉用量制备的MIP 等温吸附曲线Fig.1 MIP isothermal adsorption curve of the preparation of different dosage of imidacloprid

不同模板分子用量制得的MIPs 的扫描电镜图如图2 所示。可以看出，模板分子的用量对聚合物的表面形态有较大的影响。吡虫啉浓度为2 mmol 时，制得MIPs 粒径较均匀，孔穴较多，当吡虫啉浓度增大到3 mmol 时，聚合物有明显的结块现象。

2.2 交联剂用量对MIPs 性能的影响

交联剂是成功制备分子印迹聚合物的一个重要因素，它控制聚合物的形态、印迹点的稳定性及聚合物的机械稳定性，所以交联剂的类型及用量直接影响MIPs 中交联的功能单体数目和交联度，进而影响分子印迹聚合物的选择性和结合容量［10］。分别取EGDMA 的用量为40、45 和50 mmol，吡虫啉和甲醇用量固定为2 mmol 和100 mL，按1.2 方法制备吡虫啉分子印迹聚合物，研究交联剂EGDMA 用量对MIPs的饱和吸附量和形貌特性的影响，见图3 和图4。

图2 不同模板分子用量所得MIPs 的SEM 图Fig.2 MIPs from different dosage of template molecules of SEM figure(×12 800)

图3 为不同EGDMA 用量所得印迹聚合物对不同初始浓度吡虫啉的等温吸附线。由图3 可知，随着EGDMA 用量的增大，MIPs 的吸附能力增强，但增幅不太明显。在EGDMA 用量为40 mmol 时，最大平衡吸附量为246 mg/g，EGDMA 的用量增大到50 mmol时，最大平衡吸附量增大至284 mg/g，增幅为15.44%。其原因一方面是随EGDMA 用量的增加，MIPs中结合点密度增大，从而导致吸附性能增强;而另一方面，随着EGDMA 用量的增大，制得的MIPs 刚性增强，MIPs 结构更加紧密，导致更多的结合点难于被底物接近，进而导致MIPs 的吸附能力减弱。两方面的原因综合导致EGDMA 用量的改变对吸附性能影响不明显。

图3 不同EGDMA 用量制备的MIP 等温吸附线Fig.3 MIP isothermal adsorption curve of the preparation of different dosage of EGDMA

不同交联剂用量制得的MIPs 的扫描电镜图如图4 所示。可以看出所得聚合物表面形态差异不大，粒径较均匀且都具备较好的多孔结构，有利于吸附。适当增加交联剂的用量可以增加聚合物的刚性，但用量过大时，多余的交联剂发生自身聚合，从而影响MIPs 的特异吸附［11］。

图4 不同交联剂用量所得MIPs 的扫描电镜图(×12 800)Fig.4 Different dosage of crosslinking agent from SEM picture of MIPs (×12 800)

2.3 溶剂用量对MIPs 性能的影响

在MIPs 的制备过程中，溶剂不仅对参加聚合反应的反应物如模板分子、功能单体、交联剂等有很好的溶解作用，而且还是制备MIPs 的致孔剂，会影响功能单体和印迹分子间的结合强度、动力学性质和聚合物的形态结构，特别是在非共价键的结合体系中显得尤为重要［12］。本研究选择极性物质甲醇为溶剂，分别取甲醇的用量为100、120 和150 mL，吡虫啉和EGDMA 用量固定为2 mmol 和40 mmol，按1.2 方法制备吡虫啉分子印迹聚合物，研究甲醇用量对MIPs的饱和吸附量和形貌特性的影响，实验结果见图5 和图6。

图5 为不同甲醇用量所得MIPs 对不同初始浓度吡虫啉的等温吸附线。可以看出，随着甲醇用量的增大，MIPs 的吸附能力减弱。在甲醇用量为100 mL时，平衡吸附量为246 mg/g，当甲醇用量增大至150 mL 时，平衡吸附量减小至195 mg/g，这可能是因为过多的溶剂使MIPs 的结构疏松、硬度变低而影响了吸附识别效果。

不同甲醇用量制得的MIPs 的扫描电镜图见图6。从图6 可知，当甲醇用量为100 mL 时，所得聚合物表面粒径最均匀且分散度较低。

图5 不同甲醇用量制备的MIPs 等温吸附曲线Fig.5 MIP isothermal adsorption curve of the preparation of different dosage of methanol

图6 不同溶剂用量所得MIP 的扫描电镜图(×12 800)Fig.6 Different dosage of solvent agent from SEM picture of MIPs(×12 800)

2.4 正交实验优化

根据前述单因素实验结果，选取吡虫啉(模板分子)、EGDMA(交联剂)、甲醇(溶剂)设计三因素三水平正交实验，方案如表1。以平衡吸附量和回收率为指标进行正交实验，实验结果见表2。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factor levels table of orthogonal experiment

由表2 可知，以平衡吸附量为指标时，在试验设计的范围内，3 种因素用量对聚合物的平衡吸附量的影响次序从大到小依次为:吡虫啉＞EGDMA ＞甲醇，此时的吡虫啉分子印迹聚合物的最优配方为A1B3C3，即:吡虫啉2 mmol，EGDMA 50 mmol，甲醇150 mL，AIBN 0.05 g，AA 8 mmol。此时的平衡吸附量最大，为361 mg/g。

表2 正交试验结果Table 2 The results of orthogonal experiments

当以加标回收率为指标时，在试验设计的范围内，3 种因素用量对聚合物的平衡吸附量的影响次序从大到小依次为:吡虫啉＞甲醇＞EGDMA，吡虫啉分子印迹聚合物的最优配方为A2B2C3，即:吡虫啉2.5 mmol，EGDMA 45 mmol，甲醇150 mL，AIBN 0.05 g，AA 8 mmol。此时回收率最高，为127 %。

由于2 个指标所得的最优配方不同。综合考虑，对于平衡吸附量来说，主要影响因素为A 和B，最优水平组合是A1B3;对于回收率而言，主要影响因素为A 和C，最优水平组合是A2C3。在对A1和A2进行选择时，研究发现，选择A2时平衡吸附量比选择A1减少了24%，而回收率增加了16.5%，故最优水平确定为A1。因此，制备吡虫啉分子印迹聚合物的最优水平组合为A1B3C3，即:吡虫啉2 mmol，EGDMA 50 mmol，甲醇150 mL，AIBN 0.05 g，AA 8 mmol，此时所得MIPs 的静态吸附的平衡吸附量为361 mg/g，固相萃取回收率为94.6 %。

2.5 聚合物的吸附特性

对最优组合制备的MIPs 与NIPs 比较其平衡吸附量和回收率，结果如表3 所示，表明所得印迹聚合物对吡虫啉具有特异性吸附。这是由于模板分子的加入导致模板与功能单体间形成了稳定的复合物，当模板分子被洗脱后，在聚合物内部形成了形状和官能团位置均与吡虫啉相配合的空腔，正是由于这些空腔的存在，使MIPs 对模板具有良好的选择性结合能力。虽然NIPs 和吡虫啉也能形成氢键，但由于位置关系，不具有作用位点的匹配，阻碍同其他分子的作用，因此对吡虫啉的吸附量较小。

表3 MIPs 吸附特性Table 3 Adsorption characteristics of MIPs

2.6 Scatchard 分析结果

对吸附等温线的结果进行Scatchard 分析，分析结果如图7 所示。可以看出Q/c 与Q 呈非线性关系，将图中散点分为2 个部分分别进行线性回归可以得出2 条直线，线性方程分别为:Q/c = 11.467 -0.060 9 Q 以及Q/c =0.854 1 -0.001 4 Q。结果表明在研究的范围之内，MIPs 对模板分子的吸附本质并非均一相同的，MIPs 对模板分子的吸附可能存在2种吸附作用，一种为表面吸附，贡献主要来自于物理吸附;另一种为化学结合位点吸附。根据直线的斜率和截距可以分别计算出两类吸附的平衡解离常数Kd和最大表观吸附量Qmax分别为:Kd1=16.42 mg/L、Qmax1= 188.29 mg/g;Kd2= 714.29 mg/L、Qmax2=610.08 mg/g。

图7 吡虫啉分子印迹聚合物Scatchard 方程分析图Fig.7 Imidacloprid molecularly imprinted polymer Scatchard equation analysis diagram

3 结论

本文以丙烯酸(AA)为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)为交联剂，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，在甲醇溶液中用悬浮聚合法合成了吡虫啉分子印迹聚合物。通过对所得分子印迹聚合物平衡吸附量、回收率和表观特性的研究，采用正交实验优化得到最优配方为吡虫啉2 mmol，EGDMA 50 mmol，甲醇150 mL，AIBN 0.05 g，AA8 mmol，此时MIPs 的饱和吸附量为361 mg/g，回收率为94.6%。

对优化合成得到的吡虫啉分子印迹聚合物的吸附性能进行研究，与非印迹聚合物的平衡吸附量和回收率对比表明所得MIPs 具有特异吸附性。Scatchard分析表明，所得吡虫啉分子印迹聚合物存在2 种不同的结合位点，最大表观吸附量(Qmax)和平衡离解常数(Kd)分别为Kd1=16.42 mg/L、Qmax1=188.29 mg /g;Kd2=714.29 mg/L、Qmax2=610.08 mg/g。研究结果表明吡虫啉分子印迹聚合物可望作为固相萃取材料对复杂样品中吡虫啉进行提纯和富集。

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