谷氨酰胺转移酶改性对花生蛋白膜性能的影响*

张春红，高爽，王六强，李晨

(沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳，110161)

近年来，随着环境问题日益受到重视，人们使用可降解和可再生资源保护环境的意识不断提高［1］。对一些动物蛋白和植物蛋白的研究证明了天然蛋白作为可食性包装材料的可行性，其中花生蛋白因为来源广泛，营养丰富，功能性显著，分子中存在着大量的氢键、疏水键、范德华力、离子键、配位键等作用，成为制备可食性膜的良好材料［2-3］。但与合成膜相比，花生蛋白膜的机械性能、水溶性和阻水性等还不能满足工业生产和实际应用对包装材料的要求，使其应用受到限制。目前的研究表明，对花生蛋白进行改性能够在一定程度上提高花生蛋白膜的性能，同常规的物理法和化学法改性方法相比，酶法改性具有可控性和安全性高，有效提高蛋白膜的机械强度和阻隔性能的特点［4］。

谷氨酰胺转移酶(TGase)是一种酰基转移酶，可以催化蛋白质中的谷氨酰基和赖氨酸在分子内及分子间形成ε-(γ-谷氨酰基)–赖氨酸共价交联［5］。研究表明，TGase 可以提高大豆蛋白、小麦蛋白、明胶、酪蛋白的成膜性以及膜的机械性能和阻隔性能［6-7］。但利用TGase 对花生蛋白进行改性的研究报道并不多见，本文拟利用谷氨酰胺转移酶对花生蛋白进行改性，以改善PPI 膜的性能，为花生蛋白膜的进一步研究和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

谷氨酰转移酶，泰兴市东圣食品科技有限公司;低变性花生粕，山东高唐蓝山集团公司;甘油，国药试剂公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HH-数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司;电子拉力试验机，广州标际包装设备有限公司;FTIR200 傅里叶变红外光谱分析仪，Thermo Nicolet 公司;DSC-Q10 型差示扫描量热仪，美国TA 仪器公司;DHG-9246A 型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验仪器设备有限公司;DNP-9082 型电热恒温培养箱，上海精宏实验仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花生分离蛋白的制备

花生分离蛋白(PPI)参照Narendra Reddy［2］等碱溶酸沉方法制备。

1.3.2 花生蛋白膜的制备

根据单因素和响应面优化试验结果，将制备好的PPI 配制8%(w/v)的花生蛋白溶液，加入质量分数为25%(蛋白)的甘油，用1 mol/L NaOH 将溶液pH值调到9.5，在80℃下恒温振荡40 min，待溶液冷却至40℃加入5U/g PPI 的TGase，并在40℃下反应60 min。将蛋白液涂布于自制的玻璃板上，在恒温干燥箱中65℃干燥3 h。在25℃，RH 50%环境中回软后揭膜，即为改性PPI 膜，以不添加TGase 的PPI 膜作为对照。将膜在RH 50%下平衡48 h，待测。

1.3.3 膜性能指标的测定

(1)厚度的测定

用螺旋测微器在制好的膜上随机取5 个点，测量厚度，计算其平均值作为膜的厚度。

(2)机械性能的测定

参照GB13022 -1991 的方法，将样品膜用专用磨具裁成100 mm ×15 mm 的小条，将样品条两端分别固定在电子拉力试验机的样品夹上，设定标距为50 mm，试验速度为250 mm/min，对膜的拉伸强度(Ts)及断裂伸长率(Eb)进行测定。

(3)水溶性的测定

膜的水溶性采用姜燕等的方法进行测定。将样品膜在105℃下烘干至恒重，放入盛有30 mL 蒸馏水的烧杯中，室温下溶解24 h，将膜再次烘干至恒重，根据2 次重量差计算膜的水溶性［8］。

(4)水蒸气透过率(WVP)的测定

按照GB 1037 -1988 塑料薄膜和片材透水蒸汽性试验方法(杯式法)测定。

(5)红外光谱分析

分别取适量的样品膜，在恒温干燥箱中烘干至恒重，分别取适量烘干的样品膜与溴化钾在研钵中混合研磨成粉末，在压片机上压成薄片，并在FT-IR200 傅里叶变红外光谱分析仪中进行全波段(4 000 -500 cm-1)扫描，得到膜红外谱图［9］。

(6)阻氧性的测定

在容量为250 mL 的容器中，装入20.0 g 新鲜大豆油，分别将对照及改性后的膜材覆盖容器瓶口并密封，然后贮存在60℃培养箱里陈化12 d，测定花生油的过氧化值(POV)，以花生油的过氧化值衡量膜的阻氧性［10］。花生油的过氧化值采用GB/T 5538 -2005 中的方法进行测定。

(7)差示扫描量热扫描(DSC)

采用差示扫描量热仪对样品膜的热特性进行测定。称取烘干燥至恒重的试样3 ～5 mg，密封于铝制样品盘中，设定升温速率为10℃/min，扫描温度范围为25 ～300℃。以空白样品盘作为对照。

(8)扫描电镜(SEM)观察

将样品干燥后淬断，取5 mm×3 mm 左右样品固定在样品台上喷金，在扫描电镜下观察膜断面的微观结构，并拍照。

1.3.4 数据分析

本试验中的数据通过独立的3 次重复试验得出平均值，并使用SPSS 软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 膜性能

表1 为TGase 改性对PPI 膜性能的影响，由表1可知，与对照膜(TGase-膜)相比，改性膜(TGase +膜)的Ts提高了91.69%;Eb提高了53.69%;水溶性降低了15.12%;WVP 降低了32.85%;阻氧性提高了4.97%。分析原因认为是由于TGase 催化PPI 分子使其发生交联反应，在分子内及分子间形成了酰胺键，分子间作用力的增强，使膜的拉伸强度和断裂伸长率都得到了较大程度的提高，同时膜的水溶性降低。交联反应也使膜结构更加致密，从而膜的阻隔性能亦得到提高。

表1 TGase 改性对PPI 膜性能的影响Table 1 Properties of PPI films in the presence or absence of TGase

2.2 红外光谱分析

傅立叶红外光谱(F-TIR)是一种目前最为常用的分析多肽和蛋白质二级结构的方法，它能灵敏地反映出肽链结构的变化。一般，蛋白质的IR 光谱图谱有几组特征吸收谱带，酰胺I，酰胺II 和酰胺III，其波长分别对应于1 700 ～1 600 cm-1，1 530 ～1 550 cm-1和1260 ～1300 cm-1范围，其中酰胺I 归属于C ═O伸缩振动，酰胺II 属NH 变形振动或CN 伸缩振动［11］。

图1 为PPI 膜的。由图1 可以看出，与TGase-膜分别在3404.43 cm-1和3422.31 cm-1处有较强的吸收峰，应属于羟基和胺基的吸收峰;在2935.60 cm-1和2935.05 cm-1处有吸收峰，应为CH3和CH2吸收峰;在1639.41 cm-1和1648.01 cm-1(酰胺I 区域)有吸收峰;1526.38 cm-1和1542.38 cm-1附近(酰胺II 区域)有吸收峰。通过对比可已看出，TGase+膜红外光谱中的羟基和胺基酰胺I 以及酰胺II 的特征峰发生了明显的蓝移，其他特征峰则没有明显的改变，说明TGase 主要作用于蛋白的羟基及胺基基团［9］，结合已知的TGase 作用机理可以证明了TGase 改性使PPI 分子发生交联，形成了酰胺键，从而提高了膜的机械性能。

图1 PPI 膜红外光谱图Fig.1 Infrared spectra of PPI films

2.3 DSC

蛋白质的差示扫描热量法是一种通过加热蛋白质，破坏其二级、三级、四级结构，测量变性过程中的能量变化情况来反映蛋白质结构特征的分析方法［12］。图2 为TGase-膜DSC 曲线，图3 为TGase +膜DSC 曲线。

图2 TGase-膜DSC 曲线Fig.2 DSC curve of TGase-film

图3 TGase+膜DSC 曲线Fig.3 DSC curve of TGase+ film

由图2 可知，TGase-膜从99.29℃开始吸热熔融，至134.31℃完全融化，其热焓值(△H)为90.37 J/g;由图3 可知，TGase +膜从89.74℃开始吸热熔融，至132.51℃完全融化，其热焓值(△H)为26.56 J/g。实验结果表明，经TGase 改性后，PPI 膜峰宽变大，热焓值下降。这是由于热焓值的变化与氢键即蛋白中二级结构的有序性有关，而峰宽则反映了蛋白内部结构的差异［13］。TGase 改性使蛋白分子的氢键被严重破坏，改变了分子结构，使蛋白分子的构相变为解旋的状态，直接导致蛋白分子内α –螺旋含量的减少［14］而使膜的峰宽变大，热焓值下降。

2.4 扫描电镜

图4 为对照膜断面扫描电镜图片，图5 为改性膜断面扫描电镜图片。由图4 和图5 可以看出，与对照膜相比，经TGase 改性后PPI 膜内部孔洞变小，结构更加致密。这是由于TGase 使蛋白发生交联，蛋白结构更加紧密。同时解释了TGase + 膜的阻氧性和WVP 提高的原因。

图4 对照膜扫描电镜图片Fig.4 SEM image of TGase-film

图5 TGase 改性膜扫描电镜图片Fig.5 SEM image of TGase+ film

3 结论

与对照膜相比，经TGase 改性后PPI 膜的拉伸强度、断裂伸长率和阻氧性分别提高了91.69%、53.69%和4.97%;水溶性和水蒸气透过率分别降低了15.12%和了32.85%。红外光谱图谱分析表明，TGase 主要作用于花生蛋白分子中的羟基及胺基，结合TGase 的作用机理证明TGase 改性使PPI 分子发生交联，形成了酰胺键。DSC 图谱分析表明，经TGase 改性后PPI 膜的热焓值下降，峰宽变大，说明了TGase 在使蛋白质分子交联的同时改变了花生蛋白原有的二级结构。扫描电镜图片分析表明，经TGase 改性后PPI 膜的内部孔洞变小，结构更加致密。

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