纳米银乳膏在烧伤模型大鼠血浆及组织中银的分布Δ

孙倩，马守栋，李明春（1.青岛大学药学系，山东青岛66071；.解放军401医院，山东青岛66000）

纳米银粒子由20～15 000个银原子按照一定顺序排列组成，具有独特的理化特性和生物特性。其作为一种新型高效无机抗菌材料[1]，在医学、生物学、环境保护等领域得到了广泛应用，表现出良好的抗菌杀菌作用。但银作为重金属中的一种，如过量吸收会对肝脏等组织器官产生毒副作用。因此，有必要建立快速准确测定生物样品中银含量的方法。目前，测定银含量的方法主要有电化学方法[2]、紫外分光光度法[3]、原子吸收法[4-8]、催化动力学光度法[9]，其中最常用的方法为原子吸收法。这些方法有些操作简单但灵敏度不高，有些灵敏度高但对样品处理要求较高，且测定的样品多为土壤、水质和矿物质，而测定生物样品中银含量的研究较少。电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）灵敏度高、速度快、谱线简单、干扰相对于光谱技术少、动态线性范围宽，具有很低的检测限，测定RSD可到0.1%。笔者采用ICP-MS测定纳米银乳膏[10]在烧伤模型大鼠血浆及组织中的银分布，对预测纳米银的毒性有积极作用，为纳米银早日成药提供依据。

1 材料

1.1 仪器

702型超低温冰箱（美国Thermo公司）；AE240型电子分析天平（美国Mettler公司）；Elan DRCⅡ型ICP-MS（美国Perkin Elmer公司）。

1.2 药品与试剂

磺胺嘧啶银乳膏（江门市恒健药业有限公司，批号：091003，规格：每支40 g）；乳膏基质、纳米银乳膏（规格：20 μg/g）均由解放军第401医院药厂药研室自制；银标准溶液（中国海洋研究所，标准编号：GBW08610，规格：1 000 μg/ml）。

1.3 动物

成年SD大鼠24只，♀♂各半，由青岛药物研究所中心提供，动物生产许可证号：SCXK（鲁）2011-0007。实验前7 d使大鼠熟悉实验室环境，自由摄食饮水。

2 方法

2.1 工作条件设置

仪器操作条件及主要测定参数如下：射频功率为1 250 W，脉冲电压为1 200 V，雾化气流速为0.80 L/min，等离子气流速为15 L/min。数据采集模式采用跳峰模式。

2.2 建模

实验前24 h用8%硫化钠脱去大鼠后背及臀部毛，面积约5 cm×5 cm，用乙醚麻醉，取仰卧位将大鼠脱毛处置于带侧枝的圆底烧瓶口上（内径25 mm，瓶口温度98℃），蒸气熏蒸9 s，造成5%体表总面积深Ⅱ度蒸气烧伤模型[11]。

2.3 分组与给药

将模型大鼠随机分为纳米银乳膏组、磺胺嘧啶银乳膏组、基质对照组，每组8只，分别于受伤感染处涂药0.1～0.2 cm厚，每日1次，连续30 d。大鼠单笼饲养，并用胶带将颈部固定，防止舔舐药物，第30天时大鼠创面愈合完全。

2.4 标准曲线的建立

将银标准溶液经1%HNO3逐步稀释制备成0.01、0.50、1.00、5.00、10.00 μg/ml的银标准工作溶液，在“2.1”项仪器参数条件下，以银标准工作溶液的质量浓度（x）为横坐标，测得分析峰的响应值（y）为纵坐标，建立标准曲线。得回归方程为y＝0.312 7x+0.001 3（r＝0.999 9），结果表明银检测质量浓度的线性范围为0.01～10.00 µg/ml。

2.5 检测限考察

以1%HNO3作为银标准的空白溶液，对其重复测定10次，得到3倍标准偏差对应的浓度值，即为本方法的检测限。结果检测限为0.980 ng/ml，说明ICP-MS测定银含量的灵敏度较高，可以满足生物样品中银含量的测定要求。

2.6 精密度考察

取1.00、5.00、10.00 μg/ml的银标准工作溶液，按照“2.1”项仪器参数条件设置，测定其中的银含量，重复测定8次。结果，1.00、5.00、10.00 μg/ml的银标准工作溶液中银的质量浓度分别为（1.21±0.02）、（5.03±0.13）、（10.07±0.21）μg/ml，RSD分别为1.65%、2.58%、2.09%（n＝8），说明方法精密度良好。

2.7 加样回收率试验

取基质对照组大鼠的肝脏样本20份，每份约0.2 g，5份为一组，分为空白组和低、中、高水平（0.1、1.0、10.0 µg/ml）组，精密称定后置于高效防腐消解罐中，分别加入对应质量浓度的银标准工作溶液0.25 ml，再加入2 ml的MOS级（高纯）硝酸密闭，移入150℃烘箱中加热12 h后转移至25 ml量瓶中，定容，摇匀，用ICP-MS测定组织和器官中的银含量。按公式：（测得值－空白组测得值）×0.2/（加入量×0.25）×100%计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（±s，n＝8）Tab 1Result of recovery test（ ±s，n＝8）

表1 加样回收率试验结果（±s，n＝8）Tab 1Result of recovery test（ ±s，n＝8）

组别空白组低水平组中水平组高水平组加入量，μg/ml 0 0.1 1.0 10.0测得值，μg/g 0.029 0.146 1.436 13.505加样回收率，%RSD，%93.2±3.3 112.5±1.0 107.8±1.3 3.5 0.9 1.2

2.8 银含量测定

将创面愈合完全的各组大鼠停药24 h后处死，取血，解剖，称取心、肝、脾、肾组织各0.2 g，置于高效防腐消解罐中，加入2 ml的MOS级硝酸密闭，移入150℃烘箱中加热12 h后转移至25 ml量瓶中，定容，摇匀。按照“2.1”项下设置的仪器参数，测定各组大鼠血浆和心、肝、脾、肾组织中的银含量。结果表明，与基质对照组比较，磺胺嘧啶银乳膏组大鼠血浆和心、肝、脾、肾组织中的银含量均明显增加（P＜0.05或P＜0.01），而纳米银乳膏组大鼠仅脾组织中银含量明显增加（P＜0.05）。表明纳米银在保证疗效的同时也减少了银在血浆和组织中的蓄积。各组大鼠血浆和组织中痕量银分布情况见表2。

3 讨论

纳米银粒径小、表面积大，物理、化学和生物活性均较高，带来了正面效应，也存在负面效应。纳米银能够通过呼吸道、消化道、暴露皮肤及其他途径进入体内，并很有可能在多个组织器官中分布蓄积，从而造成病理损害。因此有必要研究纳米银在体内的分布和蓄积情况，以此了解纳米银在体内迁移、分布和蓄积的生物学特性。这就首先需要建立一种快速准确地测定生物样品中银含量的方法。

表2 各组大鼠血浆和组织中痕量银分布情况（±s，n＝8）Tab2 Distribution of trace silver in plasma and tissues of rats（±s，n＝8）

表2 各组大鼠血浆和组织中痕量银分布情况（±s，n＝8）Tab2 Distribution of trace silver in plasma and tissues of rats（±s，n＝8）

与基质对照组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.base control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

血浆，μg/ml 0.231 3±0.015 2 1.471 3±0.215 7＊0.135 7±0.092 5组别纳米银乳膏组磺胺嘧啶银乳膏组基质对照组心脏，μg/g 0.211 7±0.070 1 1.378 6±0.238 3＊0.125 7±0.014 6脾脏，μg/g 0.412 6±0.089 1＊2.097 6±0.196 9＊＊0.146 2±0.015 3肝脏，μg/g 0.231 5±0.031 2 1.567 2±0.135 8＊0.127 9±0.015 8肾脏，μg/g 0.298 6±0.037 1 1.769 1±0.172 1＊0.156 2±0.017 1

相对于传统的电化学方法、紫外分光光度法、原子吸收法、催化动力学光度法等检测痕量银的方法，本研究采用ICP-MS，检测限为0.980 ng/ml，加样回收率为（93.2±3.3）%～（112.5±1.0）%。表明用ICP-MS测定银含量具有极低的检测限和较宽的线性范围，加样回收率较高，是一种痕量元素的强有力的分析技术。进一步用该方法测定组织和血浆中的银含量，结果表明纳米银作为一种新型抗菌材料，较磺胺嘧啶银可以有效地减少银的蓄积，因此纳米银较磺胺嘧啶银有较低的毒性。但其进入体内的方式以及对各组织器官中细胞的影响还需进一步深入研究，探讨其产生毒性的机制，从而使纳米银更好、更安全地服务于临床。

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