H2O2／O3协同灭活水中隐孢子虫影响因素研究

李金玉，冉治霖

（1．广东轻工职业技术学院环境工程系，广州 510300；2．深圳信息职业技术学院交通与环境学院，深圳 518172）

H2O2／O3协同灭活水中隐孢子虫影响因素研究

李金玉1，冉治霖2

（1．广东轻工职业技术学院环境工程系，广州 510300；2．深圳信息职业技术学院交通与环境学院，深圳 518172）

开展了H2O2／O3灭活隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）的研究。考察了H2O2和O3投加比例、过氧化氢作用效果、无机金属离子等因素的影响。结果表明，H2O2／O3协同技术具有最佳的灭活效果，H2O2的投加不仅降低了药剂（O3）的初始浓度（投量2．0mg／L），而且缩短了灭活时间（7．0 min），达到理想的灭活效果（灭活率99．0%以上）时，H2O2／O3摩尔比为0．8；同时考察了水中常见离子对H2O2／O3灭活效果的影响，低浓度的Ca2＋，Mg2＋和Cu2＋等二价金属离子均对灭活起到一定促进作用，一价离子Na＋对灭活无明显的作用，而NO－3，HCO－3和Cl－在一定范围内抑制了H2O2／O3对隐孢子虫的灭活。

隐孢子虫；H2O2／O3；饮用水；灭活

1 研究背景

隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）是一种感染能力极强的致病性微生物，能够通过食物和水进入人畜体内，引起痉挛、反胃及腹泻等不良症状，是儿童、老人和免疫缺陷者的重要的致病原［1］。免疫力较强的患者，经过适当的治疗就会痊愈，但对于免疫力较差者会导致死亡。据美国疾病控制预防中心估计，每年约有250万人感染隐孢子虫病［2］。而我国于1987年在南京首次发现了人隐孢子虫病病例，之后在江苏、重庆、安徽、内蒙古、福建和湖南均有相关病例报道［3］。

目前，已开展多种消毒剂灭活隐孢子虫的研究，其中包括：氯气、氯胺、二氧化氯、臭氧（O3）和紫外线等［4－6］。但隐孢子虫体外有一层卵囊包裹对传统的氯消毒法有极强的免疫性，单纯投加或使用一种消毒方式无法达到理想的灭活隐孢子虫的效果。前期的研究显示：Cl2投加量大于6．3 mg／L，反应时间360 min，隐孢子虫的灭活率才能达到99．0%；而ClO2投加量为3 mg／L，反应时间120 min，方可达到相同的灭活效果；O3能够快速有效地杀灭隐孢子虫，隐孢子虫浓度为105个／L，O3投量为3 mg／L，作用时间达到10 min，能达到预期的效果［7－9］。

近年来，多种消毒方式耦合联用技术被广泛使用［10－11］，为进一步探索提高隐孢子虫灭活效果的可行性，本研究耦合联用H2O2和O3技术，通过探讨单独使用H2O2，O3投加比例、过氧化氢作用效果、温度、pH值、浊度、有机物等因素的影响，以求找出H2O2／O3灭活水中隐孢子虫效果的最佳条件，以期为实际工程中使用H2O2／O3灭活饮用水中隐孢子虫提供依据。

2 材料与方法

2．1 实验材料

隐孢子虫采于患病猴，经过筛、硫酸锌漂浮和蔗糖梯度离心等步骤，得到浓度为1．0×107个／mL隐孢子虫样品，以2．5%重铬酸钾悬浮保存于4℃冰箱。

臭氧：将O3通入棕色瓶中，内装有1 L PBS缓冲溶液（pH＝7．0），用靛蓝比色法测定溶解的臭氧浓度。

过氧化氢（30%）标定方法为：用移液管精确移取待测溶液至一系列的25 mL具塞比色管中，加入一定量0．05 mol／L草酸钛钾溶液并调节其pH，摇匀后放置一定时间，用1 cm比色皿在最大吸收波长下，以空白待测溶液（未调pH值，也未加显色剂的溶液）为参比，测定其吸光值。

2．2 试剂及设备

2．2．1 试 剂

4，6－二脒基－2－苯基－吲哚（DAPI）：Sigma USA；普匹碘胺（PI）：Sigma USA；HBSS平衡盐溶液：Sigma USA。

2．2．2 仪器设备

臭氧发生器为CT－KG2型（广州益田环保设备有限公司）；荧光显微镜：OLYPUS BK50；浊度：HACH浊度测定仪；腐殖酸浓度：岛津TOCVPN型测定仪；pH值：上海精科PHS－3C型pH计；以Merck NOVE 60多参数水质分析仪测定NO－，SO2－，HCO－，Ca2＋，Mg2＋和Cu2＋等离子浓度。

2．2．3 方 法

取0．5 mL PBS（磷酸缓冲溶液）保存样品，加入1 mL HBSS平衡盐溶液漂洗2次；沉淀于160μL HBSS平衡盐溶液中，加入20μL DAPI，20μL PI储备液，37℃温浴1h。温浴后加入1 mL HBSS清洗3次，洗去未染上颜色的DAPI和PI。涂片，荧光显微镜下镜检，各样品分别取200个卵孢囊镜检。

2．3 实验方法

分别将H2O2，O2和H2O2／O3通入一棕色瓶，内装有1 L 0．01 mol／L的磷酸钠缓冲液，调节pH值。取若干支10 mL比色管，分别加入稀释后不同浓度的H2O2和O2缓冲溶液，并迅速投加1×106个／mL隐孢子虫悬浮液，摇床转速为100 r／min，避光反应。检测H2O2，O2和H2O2／O3对隐孢子虫的灭活效果，找出最佳H2O2／O3投加比例和作用时间，并探讨在最佳灭活条件下不同浊度、温度、pH值、有机物浓度等对灭活效果的影响。

3 结果与讨论

3．1 H2O2，O2单独投加对灭活隐孢子虫影响

为验证H2O2／O3产生的羟基自由基对隐孢子虫的灭活作用，检测O3和H2O2单独作用对隐孢子虫灭活率的影响，见图1。可以看到投加5．0 mg／L的H2O2后，隐孢子虫的存活率与未投加情况下的几乎一致，此结论与Susan等［10］的报道一致。所选取的H2O2投加浓度5．0 mg／L高于文献中的报道浓度。在含有隐孢子虫的溶液中，分别投加0．5，1．0， 2．0和3．0 mg／L的O3后，从图中可以发现，随着反应时间的增加，隐孢子虫的灭活率提高，臭氧投量大于3．0 mg／L，作用时间大于11 min，隐孢子虫的存活率小于0．1%，可以达到预期灭活效果（灭活率＞99．9%）。

图1 O3和H2O2单独作用隐孢子虫灭活率变化Fig．1 The effect of O3and H2O2alone on the inactivation of C．parvum

3．2 灭活隐孢子虫最优H2O2／O3摩尔比

当臭氧的初始浓度为0．5，1．0，2．0和3．0 mg／L，分别配置H2O2／O3的摩尔比为0．1，0．3，0．8和1．2，隐孢子虫浓度为1×106个／mL，培养箱保持反应温度20℃，pH值为7．0，高岭土调节浊度为1．0 NTU，避光反应。利用荧光活性染色法，检测不同作用时间隐孢子虫的灭活率，结果见图2。从图2中可以发现：H2O2／O3协同作用灭活隐孢子虫的效果明显好于O3单独作用。当O3初始浓度为3．0 mg／L时，作用时间为11．0 min，隐孢子虫的灭活率可以达到99．9%。

图2 不同初始浓度时H2O2／O3摩尔比对灭活隐孢子虫的影响Fig．2 The effect ofmolar ratio on the inactivation of C．parvum w ith different initial O3concentrations

当体系中加入H2O2，灭活率提高。O3初始浓度为3．0 mg／L，达到99．9%的灭活率仅需要5．0 min，此时H2O2／O3的摩尔比为0．8，如果作用时间仅为5．0 min，隐孢子虫灭活率97．5%。如降低O3初始浓度（0．5，1．0 mg／L），达到灭活率99．0%时的作用时间分别为11．0和9．0 min（图2（a）和图2（b）），灭活效果与单独使用O3（浓度2．0 mg／L）相当。结果表明：H2O2／O3不仅明显加快灭活速度，且减少O3投量，显著提高了灭活效果。因此，O3初始浓度为2．0 mg／L，作用时间为7．0 min，H2O2／O3摩尔比为0．8时即可达到最佳效果。

H2O2／O3联用主要是利用臭氧分解产生的羟基自由基（·OH）来氧化有机物，而在臭氧水溶液中加入过氧化氢，可显著加快臭氧分解产生羟基自由基。臭氧与水中OH－反应生成HO－2·，H2O2会部分离解也生成为HO－2·，而HO－2·是羟基自由基的诱发剂，能显著加快臭氧的自分解生成HO－2·。·OH是一种重要的活性氧，从分子式上看是由氢氧根（OH－）失去一个电子形成。羟基自由基具有极强的氧化能力，氧化电位2．8 V，是自然界中仅次于氟的氧化剂，对细菌或病毒细胞具有强破坏能力。虽然目前的研究并未能完全解释羟基自由基灭活微生物的机理，但有2种解释：①羟基自由基产生的强电位可破坏细胞壁或形成细胞膜分化，或者直接与细胞膜反应，改变细胞膜结构，影响细胞通透性，从而引起细胞死亡［11］；②羟基自由基可以进入细胞内灭活呼吸代谢酶系或者破坏细胞内成分，如核酸等，从而干扰蛋白质合成，致使细胞凋亡［12］。

有文献报道，当H2O2加入O3反应体系中，可作为重要的诱发因子，促进氧化反应。加入H2O2后，一部分O3分解为HO－2，其具有更强的氧化能力，同时可以加速臭氧降解，可以说H2O2促进了臭氧的氧化过程［13］。

3．3 羟基自由基作用

为了确定反应体系中羟基自由基的存在及浓度变化，加入叔丁醇（TBA）和HCO－32种自由基抑制剂。其通过消耗羟基自由基（·OH）的剂量，中断自由基链式反应，从而影响了氧化能力。

图3为叔丁醇（TBA）和HCO－3与H2O2／O3作用后，对隐孢子虫灭活率的影响。反应条件为H2O2／O3摩尔比0．8，作用时间5．0 min，浊度为1．0 NTU，温度22℃。从图3中可以看出：当体系中加入TBA和HCO－32种自由基抑制剂后，隐孢子虫的灭活率迅速下降。当分别加入浓度为100 mg／L TBA和HCO－3，隐孢子虫的灭活率分别下降到50．6%和53．8%，抑制剂浓度越大，抑制作用越显著。

图3 TBA和HCO－3对H2O2／O3灭活隐孢子虫的作用Fig．3 Effect of TBA and HCO－3on the inactivation of C．parvum

3．4 水中常见离子的影响

自然水体中含有多种无机离子，且浓度比需去除的有机污染物高得多（几十至几百mg／L），水中无机离子可能也是影响H2O2／O3作用隐孢子虫灭活率的重要因素。在反应体系中分别加入水中常见无机离子（Ca2＋，Cu2＋，Zn2＋，Na＋，HCO－3，Cl－），与未加离子的体系比较，利用荧光染色法检测隐孢子虫存活率。

浊度1．0 NTU，O3浓度3．0 mg／L，pH值为7．0，隐孢子虫浓度为1×106个／mL，H2O2／O3摩尔比为0．8，温度20℃，体系中分别加入不同浓度的Ca2＋，Cu2＋，Zn2＋，Na＋，HCO－3和Cl－，荧光活性染色法检测其对H2O2／O3灭活隐孢子虫的影响，结果果见图4（a）至图4（f）。

图4（a）中低浓度的Ca2＋（1．0，2．5 mg／L）一定程度上促进灭活率的提高，与对照组比较，此2种浓度的平均灭活率分别提高0．15%和0．19%。但随着Ca2＋浓度的增加，H2O2／O3作用隐孢子虫灭活率逐渐降低，当Ca2＋浓度达到20．0 mg／L时，平均灭活率降低4．2%。

Cu2＋的作用效果（图4（b））与Ca2＋近似，低浓度（0．5，1．0 mg／L）的Cu2＋可以促进灭活，当浓度逐渐提高至1．5和2．0 mg／L，灭活率低于对照水平（下降了0．26%）。随着浓度的进一步增加（2．0～10．0 mg／L），出现了与Ca2＋作用效果不同的现象，隐孢子虫的灭活率随着Cu2＋浓度的增加而提高。其原因可能是Cu2＋与二价金属离子Fe2＋相同，可以提高羟基自由基的产生［14］。

Zn2＋浓度0．5～10．0 mg／L并未明显地促进或者抑制隐孢子虫的灭活（见图4（c））。从图4（d）中可以看出，Na＋并未明显地促进或者抑制隐孢子虫的灭活率，效果与Zn2＋的作用基本一致。

图4 不同无机离子对H2O2／O3灭活隐孢子虫的影响Fig．4 Effect of different inorganic ions on the inactivation of C．parvum．

4 结 论

（1）单独投加H2O2对隐孢子虫并未有很强的灭活效果；单独使用O3，其投量需大于3．0 mg／L，作用时间大于11 min，隐孢子虫的存活率小于0．1%，可以达到预期灭活效果（灭活率＞99．9%）。

（2）H2O2／O3联用不仅可以明显加快灭活速度，而且可以减少O3投加量，显著提高了灭活效果。因此，O3初始浓度为2．0 mg／L，作用时间为7．0 min，H2O2／O3最佳摩尔比为0．8时即可达到最佳灭活效果。

（4）低浓度的Ca2＋（1．0，2．5 mg／L）一定程度上促进灭活率的提高，随着Ca2＋浓度的增加，H2O2／O3灭活作用逐渐降低，当Ca2＋浓度达到20．0 mg／L时，平均灭活率降低4．2%；Cu2＋的作用效果与Ca2＋近似；Zn2＋浓度0．5～10．0 mg／L并未明显地促进或者抑制隐孢子虫的灭活率；Na＋的效果与Zn2＋的作用基本一致；Cl－抑制了H2O2／O3对隐孢子虫的灭活，但其强度弱于的作用。究其原因可能是Cl－可以捕获溶液中的·OH，从而降低了H2O2／O3对隐孢子虫的灭活率。

［1］ SHAHIDUZZAMANM，DYACHENKO V，KEIDEL J，et al．Combination of Cell Culture and Quantitative PCR（cc－qPCR）to Assess Disinfectants Efficacy on Cryptosporidium oocysts under Standardized Conditions［J］．Veterinary Parasitology，2010，167（1）：43－49．

［2］ FURNESSBW，BEACH M J，ROBERTS JM．Giardiasis Surveillance－United States，1992－1997［J］．Morbidity and Mortality Weekly Report CDC Surveillance Summary，2000，49（7）：1－13．

［3］ 金云霄，张立成，傅金祥．介水隐孢子虫病的防治措施与方法［J］．给水排水，2005，31（4）：42－45．（JIN Yun-xiao，ZHANG Li-cheng，FU Jin-xiang．Control of Water-borne Cryptosporidiosis［J］．Water and Wastewater Engineering，2005，31（4）：42－45．（in Chinese））

［4］ HODON R，DANIELG，JOHN CC．Photocatalytic Inactivation of Cryptosporidium parvum with TiO2and Lowpressure Ultraviolet Irradiation［J］．Water Research，2008，42（6／7）：1523－1530．

［5］ KING B J，HOEFELD，DAMINATO D P．Solar UV Reduces Cryptosporidium parvum oocyst Infectivity in EnvironmentalWaters［J］．Journal of Applied Microbiology，2008，104（5）：1311－1323．

［6］ KIMA J H，MICHAEL S E，GUNTENC U．Modeling Cryptosporidium parvum oocyst Inactivation and Bromate in a Flow-through Ozone Contactor Treating NaturalWater［J］．Water Research，2007，41（2）：467－475．

［7］ RAN ZL，LISF，HUANG JL，et al．Study on the Inactivation of Cryptosporidium by Ozone and Cell Ultrastructures［J］．Journal of Environmental Science．2010，22（12）：1954－1959．

［8］ 冉治霖，李绍峰，朱 静，等．二氧化氯灭活水中隐孢子虫的影响因素及机理研究［J］．中国环境科学，2011，31（6）：904－909．（RAN Zhi-lin，LIShao-feng，ZHU Jing，et al．Cryptosporidium Inactivated by Chlorine Dioxide in Water and Disinfect Mechanisms［J］．China Environmental Science，2011，31（6）：904－909．（in Chinese））

［9］ 冉治霖，李绍峰，黄君礼，等．氯气灭活饮用水中隐孢子虫的影响因素［J］．中国环境科学，2011，30（6）：786－790．（RAN Zhi-lin，LIShao-feng，HUANGJun-li，etal．Effectof Various Factors on Chlorine Inactivating Cryptosporidium in Water［J］．China Environmental Science，2011，30（6）：786－790．（in Chinese））

［10］SUSAN L B，DAVID JW，MARK D S，et al．Inactivation of Cryptosporidium parvum oocyst Infectivity by Disinfection and Sterilization Processes［J］．The American Society for Gastrointestinal Endoscopy，1999，49（5）：605－611．

［11］MARTIJN A J，KRUITHOF J C．UV and UV／H2O2Treatment：The Silver Bullet for By-productand Genotoxicity Formation in Water Production［J］．Ozone：Science and Engineering，2012，34（2）：92－10．

［12］CHANG L，CRAIK S．Laboratory Simulation of the Effect of Ozone and Monochloramine on Biofilms in Drinking Water Mains［J］．Ozone：Science and Engineering，2012，34（4）：243－251．

［13］ANZAI K，KUNITAKA O，GOTO Y，et al．Oxidation Dependent Changes in the Stability and Permeability of Lipid Bilayers［J］．Antioxid Redox Signal，1999，1（3）：339－347．

［14］WOLFE R L，STEWART H，SCOTT K N，et al．Inactivation ofGiardiamuris and Indicator Organisms Seeded in SurfaceWater Supplies by Peroxone and Ozone［J］．Environmental Science and Technology，1989，23（6）：744－745．

（编辑：赵卫兵）

Synergistic Effect of H2O2／O3on the Inactivation of Cryptosporidium parvum in W ater

LI Jin-yu1，RAN Zhi-lin2
（1．Department of Environmental Engineering，Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，China；2．Department of Transportation and Environment，Shenzhen Institute of Information Technology，Shenzhen 518172，China）

In order to research the synergistic effect of H2O2／O3inactivating Cryptosporidium parvum in water，factors including the proportions of H2O2and O3，the effectof hydrogen peroxide，and the inorganicmetal ion were investigated by using fluorescence stainingmethod．It could achieve the desired inactivation of Cryptosporidium parvum（inactivation rate above 99．0%）．H2O2not only reduces the initial concentration of bactericide（O3dosage of 2．0 mg／L），but also shortens the sterilizing time（7．0 min）．The best H2O2／O3molar ratio is0．8．Common ions in water，such as divalentmetal ions Ca2＋，Mg2＋and Cu2＋play catalytic roles in the inactivation，while Na＋has no obvious effect on the inactivation，and NO－3，HCO－3and Cl－restrain the inactivation of Cryptosporidium parvum to some extent．

Cryptosporidium parvum；H2O2／O3；drinking water；inactivation

X52

A

1001－5485（2013）09－0017－05

10．3969／j．issn．1001－5485．2013．09．004

2013，30（09）：17－21

2013－07－04

广东省自然科学基金（S2012040007855）

李金玉（1971－），女，江西吉安人，讲师，硕士，主要从事生物化学及检测技术方面的研究，（电话）13729864056（电子信箱）lijinyu101＠163．com。

冉治霖（1980－），男，河南郑州人，讲师，博士，主要从事水污染控制与资源化方面的研究，（电话）15818686856（电子信箱）ranzl＠sziit．com．cn