紫椴花提取物体外抗菌活性1)

马微微 王 军 穆立蔷

(黑龙江中医药大学，哈尔滨，150040) (中国农业大学) (东北林业大学)

紫椴(Tilia amurensis Rupr.)为椴树科(Tiliaceae)椴树属落叶阔叶乔木［1］，其花具有清热解表之功效，对感冒、发热，肾盂肾炎，口腔炎和喉炎等具有良好的治疗作用［2］，在我国民间被广泛使用。椴树属植物花中主要含有挥发油、黄酮、甾醇、脂肪酸、萜烯、香豆素等化合物，并有多种黄酮类单体化合物已被成功分离［3］。另有文献报道，欧洲产椴树具有治疗神经紊乱、失眠、头痛、感冒、发烧、支气管炎、流感、风湿等症的功效［4－9］。本研究对紫椴花及其分离各组分的抗菌活性进行了研究，以期为紫椴花抗菌药物的开发提供科学依据。

1 材料与方法

材料与仪器:紫椴花于2008年6月至7月采于东北林业大学校园内和黑龙江省农科院园艺分院，经东北林业大学穆立蔷教授鉴定为椴树科椴树属植物紫椴的花。革兰氏阳性菌有表皮葡萄球菌(Se，Staphylococcus epidermidis)、金黄色葡萄球菌(Sa，Staphylococcus aureus)、柠檬色葡萄球菌(Sc，Staphylococcus citreus);革兰氏阴性菌有大肠杆菌(Ec，Escherichia coli)、变形杆菌(Pv，Proteus vulgaris);真菌有白色念珠菌(Ca，Candida albicans)。供试菌种均由黑龙江中医药大学微生物实验室提供。牛肉膏、蛋白胨、琼脂均购自北京奥博星生物技术有限责任公司;化学试剂均为分析纯。

提取物的制备:取干燥的紫椴花500 g，加8倍量的70%乙醇，浸泡12 h，回流提取3次，每次2 h，得到70%乙醇提取物;将乙醇提取物用蒸馏水溶解后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水溶物。

菌悬液的制备:将供试菌种用适宜的斜面活化后，以无菌水制成含菌数约为108cfu·mL－1的菌悬液。

抑菌直径的测定:采用琼脂扩散法测定。用无菌棉签蘸取108cfu·mL－1的试验菌悬液，在营养琼脂平板表面均匀涂抹3次，然后绕平板边缘涂抹一周，盖好平皿，室温干燥5 min，滤纸片(直径6.0 mm)平放于无菌平皿内160℃干热灭菌2 h。在滤纸片上分别滴加阳性对照品链霉素(1 g·L－1)、供试样品乙醇提取物(500 g·L－1)、石油醚部位(100 g·L－1)、乙酸乙酯部位(100 g·L－1)、正丁醇部位(100 g·L－1)、或水溶物(100 g·L－1)溶液 20 μL，开盖室温自然晾干，用无菌镊子将样片轻轻贴放于平板表面，每个平板贴3片相同药液的试验样片，1片无菌生理盐水对照片。各试验菌株在相应的培养条件下培养。测量抑菌直径，试验重复3次。

MIC及MBC的测定:采用微量肉汤稀释法测定。MIC为最低抑菌质量浓度，即药物与一定质量浓度的菌液作用后能够抑制可见菌生长的最低质量浓度;MBC为最低杀菌质量浓度，即在MIC基础上，从每管吸取10 μL混合液，点于固体培养基上，继续按MIC培养条件培养，以杀灭99.9%细菌数量的最低质量浓度。采用二倍稀释法将供试样品用无菌生理盐水稀释系列浓度，在96孔板上每孔加100 μL不同质量浓度的药液和100 μL菌液，使最终菌液浓度为(1 ～5)×105cfu·mL－1，以无菌生理盐水加菌液作为对照，重复3次。

2 结果与分析

2.1 抑菌效果分析

从表1 可看出，全部样品对 Se、Sa、Sc、Ec、Pv、Ca 6种菌种均具有不同程度的抑制作用。其中70%乙醇提取物(500 g·L－1)和乙酸乙酯萃取物(100 g·L－1)的抑菌效果明显高于其他提取物;而乙酸乙酯萃取物(100 g·L－1)对6种菌种的抑菌效果明显高于阳性对照组链霉素，其对6种菌种的抑制程度由大到小为 Sc、Se、Ca、Sa、Pv、Ec。可见，紫椴花对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及真菌均具有显著的抑制作用，但对革兰氏阳性菌及真菌的抑制效果好于革兰氏阴性菌。

乙酸乙酯萃取物是从70%乙醇提取物中分离出的一个组份。从表1可见，70%乙醇提取物的抑菌效果稍低于乙酸乙酯萃取物，但明显高于石油醚萃取物、正丁醇萃取物以及水溶物，表明70%乙醇提取物中抑菌活性物质主要集中在乙酸乙酯组份中，这为下一步紫椴花抑菌活性成分的研究提供了方向。

表1 紫椴花提取物对供试菌种的抑菌直径 mm

2.2 MIC及MBC结果

对紫椴花各组分MIC及MBC的测定结果见表2。由结果可看出:石油醚萃取物和水溶物在20 g·L－1范围内无抑菌活性。正丁醇萃取物对Sa和Ec在20 g·L－1内无抑菌活性，而对 Se、Sc、Pv、Ca 有一定的抑菌活性。乙酸乙酯萃取物对Se、Sa、Sc、Ec、Pv、Ca 6种菌种均具有明显的抑菌活性，MIC分别为0.625、1.250、0.313、2.500、1.250、0.313 g·L－1，MBC 分别为 1.250 L、2.500、0.313、10.000、2.500、0.625 g·L－1，其对革兰氏阳性菌及真菌的作用效果明显高于革兰氏阴性菌。而70%乙醇提取物在20 g·L－1质量浓度内无显著抑菌活性，但在25～50 g·L－1内显示出抑菌活性，说明70%乙醇提取物中具有抑菌成分，从中分离出的乙酸乙酯萃取物，是其抑菌作用的有效化学组份。乙酸乙酯组份的MIC及MBC均小于70%乙醇提取物，这也符合中药有效成分药效比中药提取物效果明显的规律，进一步说明了乙酸乙酯组份为紫椴花抑菌活性的有效部位。

表2 紫椴花各提取物的MIC及MBC g·L－1

3 结束语

紫椴花70%乙醇提取物对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌均具有明显的抑菌活性，其中乙酸乙酯部位的抑菌效果最好，其对革兰氏阳性菌及真菌的抑菌效果好于革兰氏阴性菌。说明紫椴花具有广谱杀菌的作用，其作用的有效部位为乙酸乙酯部位。本研究为紫椴花抗菌药物的开发提供了科学依据，为紫椴资源的综合利用提供了方向。

［1］ 周以良.黑龙江树木志［M］.哈尔滨:黑龙江科学技术出版社，1986.

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