鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌生物被膜的影响

王 艳，程惠娟*，朱玲玲，孙振新，李露天

(安徽中医药大学，安徽 合肥 230038)

每年由细菌感染造成的死亡人数超过13万，是世界第二大死亡原因，其中细菌对抗生素的耐药性对人类生存构成了重大威胁[1]。细菌形成的生物被膜是细菌易产生耐药性的重要因素。1978年Costerton首先发现并提出了生物被膜(biofilm)理论[2]。随后，一些研究者在难治性的慢性呼吸道感染、慢性泌尿系感染、骨髓炎、心内膜炎、前列腺炎的病例中，都发现了生物被膜细菌[3]。细菌的生物被膜是细菌为适应周围不利环境，分泌的多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等将其自身包绕其中形成的膜样物，是细菌群体生长的一种方式，较之于浮游菌，被膜内菌对抗生素及杀菌剂耐受力更强[4-6]，因此，寻找以生物被膜为靶向的药物是解决目前细菌耐药性的重要突破口。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)是一种常见的院内感染条件致病菌，被世界卫生组织公认为医院内感染的主要病原菌之一，临床上常见于呼吸道感染[7]。该菌在感染机体过程中常以生物被膜方式存在，以此来阻隔抗生素的攻击[8-9]。在前期的研究中，课题组成功通过体外铜绿假单胞菌产膜株的感染建立了肺气虚证的模型[10-13]，并针对此病理模型的治疗进行了大范围的药物筛查。

鱼腥草为三白草科蕺菜属植物蕺菜的干燥地上部分和新鲜全草，味辛、微寒、归肺经，具有清热解毒、利尿通淋、止血、祛痰止咳、镇痛等多种功能。目前，鱼腥草被国家卫生部正式确定为“既是药品，又是食品”的极具开发潜力的植物资源之一[14-15]。鱼腥草素钠是鱼腥草的主要有效成分和亚硫酸氢钠加成物，是临床常用药物鱼腥草注射液的主要成分，具有消肿，抗化脓感染的功效。主治呼吸道感染及皮肤化脓感染[16-17]。对老年人肺炎、急性上呼吸道感染、慢性支气管炎急性发作期均有良好的疗效[18-19]。在前期的体外抗菌实验中发现，鱼腥草素钠相较抗生素而言抗菌作用不显著，但在治疗由铜绿假单胞菌生物被膜感染造成的大鼠肺气虚证模型时，效果理想。而且有实验证实鱼腥草素钠对表皮葡萄球菌生物被膜有影响[20]，因此推测该药是否通过干扰铜绿假单胞菌生物被膜的形成，解除它的生物屏蔽作用，从而促进机体的免疫因素杀灭细菌。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鱼腥草素钠标准品(批号100247-199601) 中国药品生物制品检定所；标准菌株ATCC27853 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；LB培养基、胰酶大豆肉汤培养基、M-H培养基 杭州微生物试剂有限公司；四甲基偶氮唑盐(MTT) 美国Sigma公司；二甲基亚砜(DMSO) 天津市光复精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

318酶标仪 上海三科仪器有限公司；96孔微量培养板 杭州生友生物技术有限公司；DPH-9162型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；CX21型光学显微镜 日本Olympus公司；Sirion200型场扫描电镜 美国Fei公司。

1.3 方法

1.3.1 鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌的MIC及抗菌活性

鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌的MIC参考ANSI推荐的NCCLS M7-A方案用微量稀释法进行，鱼腥草素钠以M-H培养基对倍稀释成10个质量浓度梯度：300、150、75、37.5、18.75、9.38、4.69、2.34、1.17、0.59μg/mL，分别加入96孔板中，每个质量浓度8个复孔，100μL/孔。另设一列不含鱼腥草素钠的培养基作为正常对照组，6h培养的菌液以比浊法调整到0.5号麦氏浓度，经200倍稀释后，每孔加入100μL，振荡，37℃培养18h，以无菌生长的最小药物稀释度为MIC。然后在酶标仪650nm波长处检测OD650nm值，比较各药物质量浓度的抗菌活性。

1.3.2 鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌代谢影响

将鱼腥草素钠用胰酶大豆肉汤稀释成10个质量浓度梯度：300、150、75、37.5、18.75、9.38、4.69、2.34、1.17、0.59μg/mL，分别加入96孔板，100μL/孔，每个质量浓度8个复孔，第11、12列的8个复孔中加入100μL不含鱼腥草素钠的胰酶大豆肉汤，11列为不加鱼腥草素钠的正常对照组，12列作为培养基空白对照，1～11列各孔中加入100μL 1×104CFU/mL的细菌悬浮液；37℃培养每隔48h换一次含药培养基，设1、3、7d 3个时间点，MTT法在酶标仪492nm波长处检测OD492nm计算SMIC50和SMIC80。

1.3.3 鱼腥草素钠抗铜绿假单胞菌生物被膜动态过程的形态观察

选用SMIC80作为含药培养基的药物最终质量浓度，将含药培养基分别加入到六孔板中设1、3、7d时间点3个孔，3.6mL/孔，另设相应不含药正常对照孔，将400μL的1×104CFU/mL的铜绿假单胞菌的菌体混悬液加入六孔板中，各孔放入1片无菌盖玻片作为载体，37℃培养，每48h换一次含药培养基，分别取出盖玻片，PBS充分清洗浮游菌后镀银染色，扫描电镜下观察形态。

1.3.4 载体滤膜上活菌计数

体外生物被膜构建同1.3.3节。设鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌代谢影响实验中测得的SMIC50药物质量浓度为低剂量药物组，SMIC80药物质量浓度为高剂量药物组，载体选用孔径0.22μm医用滤膜，设1、3、7d 3个时间点分别取出滤膜，用生理盐水多次漂洗，洗去浮游菌，滤膜剪碎放入存有5mL无菌生理盐水的试管，超声振荡(超声频率40kHz)20min，使膜内菌释放，连续稀释法，倾注培养计算活菌数。

1.3.5 统计方法

2 结果与分析

2.1 鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌的MIC及抗菌活性

鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌的MIC为300μg/mL，由图1可知，与正常对照组比较，300μg/mL鱼腥草素钠抗铜绿假单胞菌作用显著(P＜0.01)，随着鱼腥草素钠质量浓度减小，抗菌活性减弱，150、75、37.5μg/mL鱼腥草素钠之间还有一定的抗菌活性(P＜0.05，P＜0.01)。

图 1 鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌抗菌活性(±s，n=4)Fig.1 Antibacterial activity of sodium houttuyfonate against Pseudomonass aeruginosa (±s，n=4)

2.2 鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌代谢影响

不加药的含菌培养孔的OD492nm为1，含药孔的光密度是对照孔的0.2、0.5倍即为SMIC80、SMIC50，结果见表1。SMIC80、SMIC50和正常对照组相比差异显著(P＜0.01)，见图2。

表1 鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌的SMIC(±s，n=4)Table 1 SMIC of sodium houttuyfonate against Pseudomonas aeruginosa (±s，n=4)μg/mL

表1 鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌的SMIC(±s，n=4)Table 1 SMIC of sodium houttuyfonate against Pseudomonas aeruginosa (±s，n=4)μg/mL

组别 培养时间/d 1 3 7鱼腥草素钠SMIC509.3818.7537.5鱼腥草素钠SMIC8037.537.5150

图 2 鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌代谢影响(±s，n=4)Fig.2 Effect of sodium houttuyfonate on the metabolism of Pseudomonas aeruginosa ((±s，n=4)

2.3 鱼腥草素钠抗铜绿假单胞菌生物被膜动态过程的形态观察

由图3可知，正常对照组铜绿假单胞菌从黏附到成熟生物被膜形成的过程，铜绿假单胞菌培养1d在载体上已经完成了吸附并形成了微菌落集团，周围可见到少量黏液，给药组培养1d细菌量少，可见药物干扰了细菌吸附到载体上。正常对照组3d培养的载体可观察到初步生物被膜形态，细菌已经被生物被膜覆盖，但是依稀还能看到细菌形态，培养到7d时由黏液组成的生物被膜增厚，细菌完全被埋到膜内致使菌体不可见。给药组1d和3d的载体菌体清晰，但是菌体表面较药物作用7d的菌体粗糙可能是细菌还有少量黏液分泌所致，但是细菌周围未见黏液，药物作用3d的载体细菌数量多于作用1d的载体，可能是细菌在载体上繁殖所致，药物作用7d时载体菌量少，且菌体光滑，可见随着药物作用时间延长，对细菌分泌黏液抑制作用增强，且载体上细菌较3d药物作用的载体少，可能是菌体表面变得光滑不易吸附载体所致。

图 3 鱼腥草素钠抗铜绿假单胞菌生物被膜形态观察(×20000)Fig.3 Morphological observation of Pseudomonas aeruginosa biofilm formed in the presence or absence of sodium houttuyfonate(×20000)

2.4 载体滤膜上活菌计数

表2 载体滤膜上的活菌计数(±s，n=4)Table 2 Live bacterial count on carrier in the membrane filter(±s，n=4)104 CFU/mL

表2 载体滤膜上的活菌计数(±s，n=4)Table 2 Live bacterial count on carrier in the membrane filter(±s，n=4)104 CFU/mL

注：*. 与正常对照组相比差异显著(P＜0.05)；**.与正常对照组相比差异极显著(P＜0.01)。

组别 培养时间/d 1 3 7正常对照组955±2881130±3021026±451鱼腥草素钠低剂量组831±228*785±177*234±14**鱼腥草素钠高剂量组375±249**147±38**129±24**

由表2可知，鱼腥草素钠药物组载体滤膜上的活菌数明显少于未用鱼腥草素钠作用的正常对照组，其中鱼腥草素钠高剂量组在黏附阶段、初步生物被膜形成、成熟生物被膜形成阶段与正常对照组相比差异显著(P＜0.01)，尤其在成熟生物被膜形成阶段，低剂量组与正常对照组相比也差异显著。

3 讨 论

自然界细菌以浮游和生物被膜两种生活方式存在，当细菌处于浮游状态时常导致急性感染的发生，生物被膜状态的细菌引起慢性感染。虽然也有多种抗生素有抗生物被膜的作用，且抗生素杀菌作用较强，但是当慢性感染时，长期使用抗生素是不合适的。目前临床治疗生物被膜病仍以抗生素治疗为主，抗生素对于细菌生物被膜病的治疗是一个时间较长的过程，在抗生素选择性压力下这一过程将加大细菌耐药性变异的颇率，而天然植物药和抗生素相比具有较少形成耐药性，毒副作用小两大优点。

鱼腥草生长在中国中东部以及西南地区，作为“药食两用”植物已经有2000多年历史。鱼腥草、鱼腥草素钠在临床治疗慢性感染性疾病有很好的疗效，由于慢性感染性疾病的反复发作、迁延不愈与细菌形成生物被膜相关，因此推测鱼腥草素钠可能通过抑制细菌生物被膜达到对慢性感染性疾病的治疗效果。本研究体外实验显示鱼腥草素钠300μg/mL抗铜绿假单胞菌的活性最强，随着药物质量浓度减少抗菌活性减弱，至18.75μg/mL及以下质量浓度几乎无抑菌作用。但是其干扰生物被膜的作用强于它的抗菌活性，根据Sauer等[21]报道的铜绿假单胞菌生物被膜的形成阶段，本实验选择1、3、7d 3个时间点作为生物被膜形成过程的黏附阶段、初步生物被膜形成阶段、成熟生物被膜形成阶段，从膜内菌代谢变化的最小抑膜质量浓度显示鱼腥草素钠有较强的抗铜绿假单胞菌生物被膜的活性，细菌培养1d是细菌的黏附阶段，抑制50%和80%的细菌黏附需要9.37、75μg/mL的药物质量浓度，培养3d干扰初步生物被膜SMIC50、SMIC80分别是18.75μg/mL和37.5μg/mL药物质量浓度，培养7d干扰成熟生物被膜SMIC50、SMIC80分别是37.5、150μg/mL。从干扰成熟生物被膜的药物质量浓度对照MIC分析，结合扫描电镜对生物被膜形态变化的观察，药物质量浓度必须要用抗菌活性才有干扰生物膜的作用。活菌培养检测表明，鱼腥草素钠在黏附，初步生物膜、成熟生物膜阶段都具有明显的干预作用。结合以上体外实验结果，鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌产膜株所致肺气虚证模型的具体影响还有待动物实验进一步证实。由于鱼腥草素钠可以通过消除生物屏蔽，进而促进抗生药物的渗透，致使药物直接作用细菌，杀灭细菌，除此之外也有利于机体抗体和吞噬细胞发挥抗感染作用。因此如果和抗生素联合治疗生物膜相关的感染，应该可以收到更好的疗效。

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