矢车菊素-3-葡萄糖苷对骨骼肌细胞脂蛋白脂肪酶活性的影响

卫晓怡，白 晨,*，唐立伟，陆 红，张靖伟

(1.上海商学院旅游与食品学院，上海 200235；2.复旦大学生命科学学院，上海 200433)

花色苷(anthocyanin)是一种广泛分布在植物中的黄酮类(flavonoid)植物化学物[1]，从食物或植物中提取的花色苷往往含有不同的花色苷元，如矢车菊素(cyanidin)、天竺葵素(pelargonidin)、芍药素(petunidin)、锦葵素(malvidin)等，糖苷也可以分为单糖苷、双糖苷、三糖苷等结构，这些不同结构的单体花色苷具有不同的生理活性。

花色苷有诸多疗效，如抗氧化[2-3]、抗动脉粥样硬化[4]、抗胰岛素抵抗[5]、调节血脂[6-7]等，其中矢车菊素-3-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-β-glucoside，Cy-3-g)是其主要活性成分。最新研究报道[8]显示，紫玉米花色苷可以抑制高脂诱导肥胖小鼠的体质量增长，但其有效成分和作用机制尚不明确，推测是紫玉米花色苷中含量为7%的Cy-3-g起了主要作用。

脂蛋白脂肪酶(lipoprtein lipase，LPL)是一种甘油三酯(triglyceride，TG)的限速性水解酶，水解血浆中的TG，使TG的1位和3位酯键断裂，释放出游离脂肪酸(free fatty acids，FFA)。同时，LPL在骨骼肌和脂肪组织中具有组织特异性，是FFA进入脂肪细胞储存或是进入骨骼肌细胞氧化利用的关键性酶，与肥胖的发生密切相关。

肌肉组织通过LPL产生FFA，FFA氧化分解提供能量。增加骨骼肌中LPL活性，可以使骨骼肌中的β-脂肪酸氧化增强，从而加速清除体内循环的TG。脂肪组织的一个主要功能就是储存脂肪。降低脂肪组织中的LPL，可以减少脂肪组织利用LPL水解TG产生的FFA合成脂肪，使FFA转移到其他具有高氧化分解作用的组织，如肌肉组织进行氧化分解。高的脂肪/肌肉LPL比，意味着使食物中摄入的脂肪更易积聚在脂肪组织；低的脂肪/肌肉LPL比，则意味着循环中的TG会更多的流向骨骼肌氧化利用，而不是流向脂肪组织积聚，利于抑制脂肪在脂肪组织中的储存，减轻体质量[9-10]。LPL在肌肉和脂肪组织中的活性，以及它们的活性比率，是机体调节膳食摄入的脂肪用于供能还是储存的关键[11]。例如，进食后脂肪组织的LPL活性会升高，肌肉组织降低[12]；反之，禁食可引起脂肪组织LPL活性降低，肌肉组织升高[13-14]。这种LPL在肌肉和脂肪中截然相反的变化，可以使机体在食物充足时，最大限度地储存能量；在食物稀缺时，为肌肉组织提供能量。

花色苷提取物可抑制小鼠肥胖[8]，但其作用机制仍不明确。本实验前期研究及相关实验结果表明，花色苷Cy-3-g通过激活成熟脂肪细胞一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)抑制LPL活性[15]。然而，Cy-3-g对骨骼肌细胞LPL的作用及其机制仍不明确，有待研究。本研究以花色苷Cy-3-g干预骨骼肌细胞，就Cy-3-g对细胞LPL活性的影响及其机制进行探讨，阐明Cy-3-g通过AMPK激活骨骼肌细胞LPL活性，调节TG代谢的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雄性SD大鼠(SPF级)，体质量180～200g。

矢车菊素-3-葡萄糖苷(Cy-3-g) 芬兰Polyphenols AS公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、胶原酶、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)、蛋白裂解液(RIPA) 美国Sigma公司；杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸-克-林二氏重碳酸盐溶液(HEPES-KRBH缓冲液)、抗生素(青霉素/链霉素)、Trizol Reagent、SYBR Green、First Strand cDNA Synthesis Kit、大鼠LPL引物合成、大鼠β-actin引物合成 美国Invitrogen公司；胰酶、胎牛血清(FBS) 美国Gibco公司；Anti-LPL Polyclonal Antibody、Anti-β-actin Monoclonal Antibody 美国Santa Cruz Biotechnology公司；Anti-pAMPK Polyclonal Antibody、AMPK Polyclonal Antibody 美国Cell Signaling Technology公司；LuminGLO®发光试剂盒 美国Thermo Scientific公司。

1.2 仪器与设备

微孔滤器(0.22μm) 德国Millipore公司；滤网 广州展晨生物技术有限公司；细胞培养板(瓶) 美国Corning公司；倒置显微镜 瑞士Leica公司；低温高速离心机(Universal 16R)、冷冻离心机 德国Hettich Zentrifugen公司；电泳仪(POWER/PAC200) 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 骨骼肌细胞分离培养

取雄性SD大鼠(180～200g)，断颈法处死，无菌条件下取骨骼肌(后腿)，PBS洗3次，剔除脂肪、结缔组织，剪碎，静置1min，弃去上层液及漂浮组织。37℃用1μg/mL胰酶的DMEM消化，每5min摇动或吹打1次离心管，然后加入培养基终止消化。4℃、2000r/min离心5min，沉淀物用含10%的胎牛血清DMEM重悬，80μm尼龙滤网过滤。血细胞计数板进行计数，细胞2×106接种于35mm的培养皿中，差速贴壁去除成纤维细胞。置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，每日更换培养基。

1.3.2 Cy-3-g对细胞毒性、增殖的测定

收集对数生长期的细胞，在96孔板以1×104细胞/孔接种细胞。用浓度1、10、20、50、100μmol/L Cy-3-g作用于细胞24h后，收集细胞培养液，吸取培养液上清进行测定。采用2,4-二硝基苯肼比色法检测Cy-3-g对骨骼肌细胞细胞毒性，即对乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)释放的影响，于540nm波长处测定吸光度。采用MTT法检测Cy-3-g对骨骼肌细胞增殖的影响。

1.3.3 Cy-3-g对细胞的干预处理

以DMSO为溶剂，配制成100mmol/L的Cy-3-g高浓度母液，使用时，将DMEM培养基稀释为一定比例浓度。细胞以终浓度为1、10、20、50、100μmol/L Cy-3-g干预3h，或者以100μmol/L Cy-3-g浓度干预1、2、3、4、5h，其中，对照样细胞加入0.1% DMSO。

1.3.4 细胞LPL活性测定

骨骼肌细胞1×104个/mL接种于培养皿。10%甲醛钙固定，行细胞非特异脂肪酶染色[16]。根据LPL能水解酯键的原理，用吐温-60孵育液(0.05mol/L Tris-HCl 90mL+5% 吐温-60 4mL+10%氯化钙4mL)与细胞一起37℃孵育12h，分解出的脂肪酸与钙结合沉淀于脂肪酶所在位置，加2%硝酸铅处理10min，以铅置换钙，经1%硫化铵液作用，形成棕色至棕黑色的硫化铅细胞，经苏木精复染细胞核5min，光镜下每张片取12个视野，平行重复3次，计细胞总数和脂肪酶染色阳性细胞数。

1.3.5 实时荧光定量RT-PCR

按T r i z o l 试剂的使用操作步骤提取总R N A，按试剂盒使用说明配制反应体系，进行R T-P C R实验，平行重复3 次，并设空白对照。各基因引物序列为：LPL (Gene Accession NO： BC003305)，(F)：5’-CCAATCGTTAGCATTTCGTTTGAG-3’，(R)：5’-T T G C G C A G T G C A G A A T T T G A-3’，β-actin (Gene Accession NO： NM_031144)(F)：5’-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCAG-3’，(R)：5’-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3’。RT-PCR扩增条件：94℃预变性1min后，进行96℃变性50s，59℃退火45s，74℃延伸45s，共35个循环。

1.3.6 Compound C抑制细胞pAMPK

骨骼肌细胞加入AMPK抑制剂Compound C 40μmol/L预处理1h后，以100μmol/L Cy-3-g干预3h为干预组，加入溶剂0.1% DMSO为对照组。

1.3.7 蛋白质免疫印迹(Western Blotting)

Western Blotting法检测骨骼肌细胞pAMPK(Thr172)以及LPL蛋白表达。Cy-3-g干预细胞结束后，用PBS洗涤细胞3遍，取适量的RIPA蛋白裂解液4℃振荡孵育10min充分裂解。收集至1.5mL离心管中，12000×g离心5min，取上清。使用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，抗体使用：LPL抗体，pAMPK (Thr 172)抗体，β-actin抗体用于测定，采用LuminGLO®发光试剂盒荧光显色。

1.4 数据处理及统计分析

采用SPPS16.0软件建立数据库，并进行统计分析。实验结果以±s表示。多组均数进行方差齐性检验(homogeneity of varirnces)和单因素方差分析(oneway ANOVA)；各组间两两比较采用 Tukey’s honestly法，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 骨骼肌细胞的形态学观察

图 1 原代骨骼肌细胞 (×100)Fig.1 Skeletal muscle cells isolated from rat hind leg (×100)

用显微镜对细胞进行形态学观察并进行拍摄，见图1。刚分离的骨骼肌细胞呈圆球状，体积较小，胞体透亮，形态完整，分散度较好，折光性强。细胞培养2h后开始出现贴壁现象；12h后，大约有90%以上的细胞贴壁生长。培养24h后，贴壁的细胞其形态上发生明显改变，细胞逐渐延展成梭形，随着培养时间的延长，细胞增殖、迁移并逐渐规律性地沿一个方向排列，自动收缩。

2.2 Cy-3-g对细胞毒性、增殖的影响

LDH是反映细胞膜完整性的一个重要指标。MTT法主要是反映线粒体的功能，MTT法显色深浅与培养板孔内活细胞数量成正比，即吸光度随活细胞的增加而升高。用1、10、20、50、100μmol/L的Cy-3-g分别与骨骼肌细胞培养24h，骨骼肌细胞各组间LDH释放、MTT吸光度无显著性差异(P＞0.05，结果略)，说明实验涉及的各Cy-3-g浓度对骨骼肌细胞无毒性及增殖影响。

2.3 Cy-3-g对骨骼肌细胞LPL活性的影响

图 2 Cy-3-g对骨骼肌细胞LPL活性的影响(±s，n=3)Fig.2 Effect of Cy-3-g on LPL activity in the skeletal muscle cells(±s，n=3)

骨骼肌细胞的LPL活性以脂肪酶染色阳性细胞数占细胞总数的百分比表示。由图2可知，Cy-3-g上调骨骼肌细胞LPL活性，具有剂量和时间效应。

2.4 Cy-3-g对细胞LPL表达的影响

图 3 Cy-3-g对骨骼肌细胞LPL mRNA以及蛋白表达的影响(±s，n=3)Fig.3 Effect of Cy-3-g on LPL mRNA and mass expression in the skeletal muscle cells (±s，n=3)

由图3可知，Cy-3-g上调骨骼肌细胞LPL mRNA以及蛋白表达，具有剂量和时间效应。

2.5 pAMPK在Cy-3-g调节细胞LPL中的作用

为明确pAMPK在Cy-3-g调节骨骼肌细胞LPL中的作用，利用pAMPK抑制剂Compound C阻断pAMPK后，用Western Blotting检测Cy-3-g对骨骼肌细胞LPL的影响。结果显示，骨骼肌细胞用100μmol/L Cy-3-g干预3h，可以激活AMPK(P＜0.001)，同时增加LPL蛋白表达(P＜0.001)。用AMPK抑制剂 Compound C可以阻断Cy-3-g对骨骼肌细胞AMPK的激活，同时LPL蛋白表达不增加，见图4。结果表明，Cy-3-g通过激活AMPK来上调细胞的LPL活性，pAMPK是Cy-3-g调节骨骼肌细胞LPL活性的上游调控因子。

图 4 pAMPK对Cy-3-g减少骨骼肌细胞LPL表达的影响(±s，n=3)Fig.4 Modulation of Cy-3-g on LPL through pAMPK activation in the skeletal muscle cells(±s，n=3)

3 结 论

本实验建立了稳定的骨骼肌细胞分离培养方法。肌肉组织增殖能力强，一般可分离培养原代骨骼肌细胞。骨骼肌细胞分离，可以采用组织块法或酶消化法进行原代培养。本实验采用酶消化法，能够较大量地分离出骨骼肌细胞。采样大鼠骨骼肌应注意去除附着的脂肪组织，用PBS清洗数次，去除含血细胞及破碎组织。初分离的大鼠骨骼肌细胞中，会伴随生长成纤维细胞，可以在细胞贴壁后，利用成纤维细胞极易为0.25%胰酶所消化而从培养瓶壁上脱落，而骨骼肌细胞贴壁牢固的特点，通过多次短时间胰酶消化，去除成纤维细胞，纯化骨骼肌细胞。

实验结果表明，骨骼肌细胞LPL的活性以及mRNA、蛋白表达则均受Cy-3-g的上调，具有剂量和时间效应；并以pAMPK抑制剂Compond C阻断Cy-3-g对AMPK的激活，结果显示Cy-3-g对骨骼肌细胞LPL的上调是通过激活AMPK产生的，pAMPK是Cy-3-g调节LPL活性的上游调控因子。

目前，有报道[17]称黄酮类物质可以调节肌肉组织中LPL，从山楂叶中提取的山楂黄酮(纯度＞94%)，剂量按4、8、6mg/kg体质量灌胃，干预高脂血症ICR小鼠8周，可以升高肌肉组织LPL含量。花色苷是一种黄酮类化合物，然而由于其碳环带有阳性氧离子、极性较强、很少以苷元的形式存在、不同的pH值条件下化学结构易发生改变等特征，提示花色苷具有一些不同于其他黄酮类物质的理化特性。本研究结果表明，Cy-3-g可上调骨骼肌细胞LPL活性以及mRNA、蛋白表达。

机体肌肉组织和脂肪组织对LPL活性的反向调节与肥胖密切相关。比如，身体锻炼可以通过升高肌肉组织的LPL活性，使得FFA氧化供能增强，从而降低脂肪组织的LPL活性，减少体质量[14]。前期及本研究结果表明，Cy-3-g在骨骼肌细胞中上调LPL以促进FFA氧化利用，在成熟脂肪细胞中下调LPL[15]以抑制其利用FFA合成脂肪并积聚，产生低脂肪/肌肉LPL比，有利于抑制机体肥胖。

AMPK作为“细胞能量的感受器”，是调节脂肪-骨骼肌之间脂代谢的纽带。AMPK激活下游靶蛋白酶，开启分解代谢，关闭合成代谢，使ATP产生增多[18]。在脂肪组织、肝脏等部位，AMPK通过抑制乙酰CoA羧化酶亚型1(acetyl CoA carboxylase，ACC-1)来抑制脂肪的合成；在肌肉、心肌等部位，AMPK通过抑制ACC-2和增强肉毒碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmitoyl transferase 1，CPT1)的活性来促进FFA的氧化[18-19]。在其作用下，糖酵解加强，肝脏糖异生减少，葡萄糖转运蛋白的表达和转位增强，细胞对葡萄糖摄取增加；脂肪酸氧化增强，脂肪合成抑制[20]。前期及本研究结果[14]表明，Cy-3-g可以激活骨骼肌细胞和成熟脂肪细胞AMPK，提示Cy-3-g通过AMPK调节脂肪-骨骼肌之间脂代谢。

有研究表明[21]，在肌细胞中AMPK是LPL的上游调控因子。二甲双胍(metformin)、AMPK激动剂AICAR(5-amino-4-imidazolecarboxamide ribonucleotide，5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷酸)可以激活L6骨骼肌细胞AMPK，并通过pAMPK上调LPL。本细胞实验通过对pAMPK的阻断，证明pAMPK是Cy-3-g调节骨骼肌细胞LPL的上游调节因子，与上述研究结果一致。

本研究结果表明，花色苷Cy-3-g通过激活AMPK上调骨骼肌细胞LPL活性，提示Cy-3-g具有潜在的调节机体脂代谢作用，与含Cy-3-g的花色苷提取物的肥胖抑制作用密切相关。

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