孙 鹏,赵旭博,孙先锋,马永征
(1.西安工程大学环境与化学工程学院,陕西 西安 710048;2.西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西 杨凌 712100;3.北京市食品研究所,北京 100162)
双歧杆菌是广泛存在于人体和动物肠道内的有益菌,具有促进机体对营养物质的吸收,调节肠道菌群平衡,增强免疫力,抗癌及抗肿瘤,降低血脂、保护及改善肝功能、调理肠道内环境、抗衰老、通便等功能[1-3],但要实现上述功能,产品中的双歧杆菌在保质期内必须保持在106CFU/mL(106CFU/g)以上[4],因此提高双歧杆菌的活菌数是产品开发的关键,培养基优化是提高活菌数的常用手段之一。
目前双歧杆菌活菌数的提高主要通过在培养基中添加果蔬汁如胡萝卜汁、番茄汁、平菇汁、卷心菜汁等[5-9],益生元如低聚果糖、菊糖及魔芋葡萄甘露低聚糖等[10-12],蛋白质及其水解产物如酪蛋白水解物、乳清蛋白水解物、乳铁蛋白及乳清蛋白等[13-16]等来实现,或以天然提取物如菊芋汁、麦芽汁等[17-19]为培养基主要成分通过培养基优化来提高双歧杆菌活菌数。如韩雪等[5]从海带汁、平菇汁及胡萝卜汁等果蔬汁中筛选了两株双歧杆菌的增殖因子,并通过正交试验进行了双歧杆菌培养基的优化;刘子宇等[6]以TPYG培养基为基础培养基,采用响应面法优化了Bifidobacterium breve A04培养基;杜鹏等[7]采用采用单因素试验和正交试验优化了婴儿双歧杆菌发酵培养基;胡德亮等[18]研究了菊芋对双歧杆菌促生长的影响;孙记录等[19]筛选优化了菊芋汁双歧杆菌培养基;Oliveira等[10]研究发现添加菊糖能缩短嗜热乳链球菌和乳双歧杆菌酸乳发酵时间,并提高了活菌数;Prasanna等[13]研究了乳清蛋白水解物等几种氮源对长双歧杆菌和婴儿双歧杆菌生长和产多糖的影响,发现在脱脂乳中添加1.5%酪蛋白水解物能促进双歧杆菌的生长;Kim等[15]研究发现牛乳铁蛋白能促进短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和两歧双歧杆菌的生长;Janer等[16]研究发现酪蛋白巨肽(caseinomacropeptide,CMP)和乳清蛋白浓缩物(whey protein concentrate,WPC)能促进乳双歧杆菌的生长,乳中添加20g/L CMP在37℃条件下培养24h能使活菌数提高1.5(lg(CFU/g)),添加20g/L WPC可使乳双歧杆菌活菌数对数值达到9.1(lg(CFU/g))。
但添加果蔬汁会导致培养基配制步骤增加,操作繁琐,不适宜用于工业化。文献中添加益生元一般仅选择添加某一种低聚糖或菊糖,没有考虑各种低聚糖或菊糖对该菌株生长的影响。此外,没考虑在培养基中添加氨基酸对双歧杆菌生长的影响。本研究以长双歧杆菌为实验对象,通过碳源、益生元及氨基酸单因素试验及Plackett-Burman试验设计筛选出主因子,再通过爬坡试验、Box-Behnken试验设计及响应面分析对长双歧杆菌的增殖培养基进行优化,以提高活菌数,为进一步开发双歧杆菌产品奠定基础。
1.1.1 菌株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum) 西安工程大学环境与化学工程学院菌种室保藏。
1.1.2 培养基与试剂
活化培养基:MRS肉汤,并添加0.5g/L滤膜过滤除菌的半胱氨酸盐酸盐;计数培养基:MRS琼脂;基础培养基:无碳源MRS肉汤。
葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、水苏糖及菊糖 西安罗森伯生物科技有限公司;氨基酸 美国Sigma公司。
SW-CJ-1F无菌操作台 苏州净化设备有限公司;DH5000AB电热恒温培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司;756PC紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;BS224S型电子天平 德国赛多利斯公司;PHS-3C型酸度计 上海精科仪器有限公司;厌氧装置(厌氧培养罐、产气袋及氧气指示剂) 日本三菱公司。
1.3.1 菌种活化
将半胱氨酸盐酸盐配成浓溶液,然后采用0.22μm的滤膜过滤除菌,再将其添加到灭菌冷却后的MRS肉汤中,使其终质量浓度为0.5g/L,将其用来活化冻干的长双歧杆菌菌粉,37℃厌氧培养24h,按体积分数5%接种量接种,活化3次后备用。
1.3.2 培养基优化
根据生长曲线确定培养时间,同时首先通过单因素试验分别考察4种碳源(乳糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖)、6种益生元(低聚果糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、低聚半乳糖、水苏糖和菊糖)、8种氨基酸(亮氨酸、谷氨酸、精氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和丝氨酸)对长双歧杆菌生长的影响,获得能促进长双歧杆菌生长的物质,再采用Plackett-Burman(PB)试验筛选主因子,接着进行爬坡试验确定最大活菌数区域,最后通过Box-Behnken试验设计及响应面分析确定最佳培养基组成,Plackett-Burman和Box-Behnken试验设计及数据处理均利用Design Expert 8.06软件完成。
1.3.3 OD值及pH值测定
采用紫外-可见分光光度计法测定培养液在600nm波长处的浊度(OD600nm值),未接入菌的培养基作为对照。通过PHS-3C酸度计测定培养液pH值。
1.3.4 活菌数测定
培养液采用10倍梯度稀释,选取适当稀释度倾注平板,使其均匀分布于培养基中,37℃厌氧培养48h后计数菌落数。
将已活化好的长双歧杆菌按照体积分数5%接种量接入含0.5g/L半胱氨酸盐酸盐的MRS肉汤中,充分混匀后37℃培养24h,每隔2h取样测定其在600nm波长处的OD600nm值、培养液pH值及活菌数,以这3个指标绘制生长曲线,如图1所示。
图 1 长双歧杆菌在MRS肉汤中的生长曲线Fig.1 Growth curve of Bifi dobacterium longum in MRS broth
由图1可知,0~4h为长双歧杆菌生长的延滞期,然后进入对数生长期,至18h进入稳定期,然后进入衰亡期,最佳培养时间为18h,此时活菌数为8.96×108CFU/mL,OD600nm值为1.154,pH值为5.15。在培养18h后,活菌数逐渐下降,而OD600nm继续增加,pH值缓慢降低,但18h后的OD600nm值不能反映培养液中的活菌数,18h之前的OD600nm值曲线和活菌数曲线趋势一致,因此在稳定期前的OD600nm值能反映长双歧杆菌的生长情况。在后续的单因素试验中测定18h的OD600nm值来判断各物质对长双歧杆菌生长的影响。
2.2.1 碳源对长双歧杆菌生长的影响
在无碳源的MRS肉汤中分别加入葡萄糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖,并将质量浓度分别调整为10、15、20、25、30g/L,118℃灭菌20min,冷却后加入过滤除菌的半胱氨酸盐酸盐,再按体积分数5%的接种量接入长双歧杆菌,37℃条件下恒温培养18h后测定OD600nm值,结果如图2所示。
图 2 碳源对长双歧杆菌生长的影响Fig.2 Effect of carbon source on the growth of B. longum
由图2可知,随着碳源添加量的增加,培养液的OD600nm值均先增大后减小,在葡萄糖、乳糖及麦芽糖质量浓度为20g/L及蔗糖质量浓度为15g/L时,培养液的OD600nm值达到最大值,分别为1.146、1.190、1.024、0.987,说明长双歧杆菌对这4种糖的利用率大小顺序为乳糖>葡萄糖>麦芽糖>蔗糖,其中碳源为蔗糖及麦芽糖时不利于长双歧杆菌的生长,其OD600nm值与葡萄糖和乳糖作为碳源的结果存在显著性差异(P<0.05),同时,葡萄糖和乳糖的最大OD600nm值间也存在显著性差异(P<0.01),因此乳糖为该菌的最佳碳源,在后续研究中以乳糖为该菌的碳源。
2.2.2 益生元对长双歧杆菌生长的影响
图 3 益生元对长双歧杆菌生长的影响Fig.3 Effect of prebiotics on the growth of B. longum
在以20g/L乳糖为碳源的MRS肉汤中分别加入低聚果糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、水苏糖及菊糖6种益生元,并将质量浓度分别调整为2、4、6、8、10g/L,118℃灭菌20min,冷却后加入过滤除菌的半胱氨酸盐酸盐,再按体积分数5%的接种量接入长双歧杆菌,37℃条件下恒温培养18h后测定OD600nm值及pH值,结果如图3所示。随着益生元添加量的增加,培养液的OD600nm值均出现了先增加后降低的情况,但均高于对照,说明益生元的添加能促进长双歧杆菌的生长。培养液OD600nm值最大时的益生元添加量分别为低聚果糖4g/L、低聚木糖2g/L、低聚异麦芽糖6g/L、低聚半乳糖8g/L、水苏糖2g/L及菊糖4g/L,对应的OD600nm值分别为1.149、1.275、1.081、1.184、1.093及1.269,其中低聚异麦芽糖和水苏糖添加量对该菌的生长没有显著的促进作用(P>0.05),其他4种益生元均能显著性促进该菌的生长(P<0.05),其中以低聚木糖最佳、其次为菊糖和低聚异麦芽糖,最后为低聚果糖。
2.2.3 氨基酸对长双歧杆菌生长的影响
将以20g/L乳糖为碳源的MRS灭菌冷却后,分别加入过滤除菌的亮氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸及丝氨酸8种氨基酸的浓溶液,并将其质量浓度均调整为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L,然后加入过滤除菌的半胱氨酸盐酸盐,最后按体积分数5%的接种量接入长双歧杆菌,37℃条件下恒温培养18h后测定OD600nm值及pH值,结果如图4所示。
图 4 氨基酸对长双歧杆菌生长的影响Fig.4 Effect of amino acid on the growth of B. longum
由图4可知,随着氨基酸添加量的增加,培养液的OD600nm值均出现了先增加后降低的情况。培养液OD600nm值最大时的氨基酸添加量为:亮氨酸0.2g/L、谷氨酸0.3g/L、精氨酸0.2g/L、赖氨酸0.2g/L、蛋氨酸0.3g/L、脯氨酸0.1g/L、苯丙氨酸0.4g/L及丝氨酸0.3g/L,对应的最大值分别为1.062、1.121、1.058、1.111、1.132、1.130、1.148及1.063,其中亮氨酸、精氨酸及丝氨酸对该菌的生长没有显著的促进作用(P>0.05),其他5种氨基酸均能显著性促进该菌的生长(P<0.05),其中以苯丙氨酸最佳、其次为蛋氨酸和脯氨酸,最后为谷氨酸和赖氨酸。
根据单因素试验结果,选用N=12的Plackett-Burman试验设计对低聚木糖、菊糖、低聚异麦芽糖、低聚果糖、苯丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、谷氨酸和赖氨酸9个因素进行考察,每个因素取高(+1)低(-1)两个水平,高水平约为低水平的1.25倍,响应值为单位体积中长双歧杆菌活菌数的对数值(Y),试验设计及结果见表1,其中X6和X11为虚拟项;因素水平取值、效应及显著性分析见表2。
表 1 Plackett-Burman试验设计与结果Table 1 Experimental results of Plackett-Burman design
表 2 Plackett-Burman试验结果及方差分析Table 2 The levels of Plackett-Burman tests and analvsis of variance
由表2可知,在培养长双歧杆菌的过程中,在α=0.10的显著水平上,低聚木糖、菊糖和脯氨酸添加量对长双歧杆菌活菌数的对数值影响显著,其中低聚木糖和菊糖添加量对培养液中双歧杆菌活菌数对数值的影响为负效应,脯氨酸为正效应,可考虑作为主要因素进一步做响应面试验。
表 3 最陡爬坡试验结果Table 3 Results of the steepest ascent experiment
响应面拟合方程只有在考察的邻近区域里才能充分近似真实情况,所以应先逼近最大影响区域后再建立有效的拟合方程。根据PB试验结果,针对低聚木糖、菊糖和脯氨酸添加量进行最陡爬坡实验,结果如表3所示。各因素的取值在第3组(0+2Δ)附近时培养液中长双歧杆菌活菌数对数值最高,故采用低聚木糖1.6g/L、菊糖3.4g/L和脯氨酸0.4g/L为后续响应面试验的中心点。
根据最陡爬坡试验确定的试验因素中心点,采用Box-Behnken试验设计对长双歧杆菌发酵培养基进行优化,各因素水平选择如表4所示,其结果如表5所示。
表 4 Box-Behnken试验因素水平及其编码Table 4 Fractors, levels and codes of Box-Behnken design
表 5 Box-Behnken试验设计及结果Table 5 Experimental design and results of Box-Behnken tests
根据表5中Box-Behnken试验设计结果,采用Design Expert 8.06软件响应面分析程序对其进行回归拟合,得到二次多元回归模型为:Y=9.22+0.041A+0.038B+0.010C-0.00008AB+0.010AC+0.0099BC-0.43A2-0.019B2-0.014C2,对二次模型进行方程分析,结果如表6所示。模型P=0.0042<0.01,失拟项P=0.1595>0.05,相关系数R2=96.38%,表明模型的相关性很好,R2Adj相关系数为89.85%,表明响应面的89.85%的变化可以由此模型解释,模型与实际情况拟合的很好。变异系数CV越低,试验的可信度和精确度越高,变异系数为0.18,试验数据可靠,分析结果可信,因此可以用此回归方程对实验结果进行分析和预测。
表 6 模型回归方程方差分析Table 6 Analysis of variance of regression equations
由表6还可看出,在α=0.05的显著水平上,A、B、及A2是显著的,AC(低聚木糖和脯氨酸)及BC(菊糖和脯氨酸)有一定的交互作用,但均不显著。利用Design-Expert软件对回归模型进行响应面分析,得到各响应面的二维等高线和三维立体图(图5~7),等高线图的圆心越接近椭圆表示交互作用越强,等高线的稀疏表示响应面图形的平陡。由3组图可知,增殖培养基中长双歧杆菌活菌数的对数值在设定的浓度范围内都有一个最大值,采用Design-Expert软件的Optimization模块,对增殖培养基进行优化,在各物质实验添加量的范围内,预测低聚木糖、菊糖及脯氨酸添加量分别为1.7、3.6、0.4g/L时,长双歧杆菌活菌数对数值的最大值为9.2489。采用上述最优添加量培养长双歧杆菌,实际获得5组平行实验平均发酵液中长双歧杆菌活菌数为(1.75±0.02)×109CFU/mL,其对数值为9.244±0.006,与预测值接近,可见该模型能较好地预测实际发酵液中长双歧杆菌活菌数的对数值。
图 5 低聚木糖与菊糖对长双歧杆菌生长影响的等高线图及响应面图Fig.5 Surface and contour plots for the effect of xylooligosaccharide and inulin on the growth of B. longum
图 6 低聚木糖与脯氨酸对长双歧杆菌生长影响的等高线图及响应面图Fig.6 Surface and contour plots for the effect of xylooligosaccharide and proline on the growth of B. longum
图 7 菊糖与脯氨酸对长双歧杆菌生长影响的等高线图及响应面图Fig.7 Surface and contour plots for the effect of inulin and proline on the growth of B. longum
实验证明,Plackett-Burman设计与响应面方法(RSM)相结合的试验统计方法能快速、有效地从众多影响长双歧杆菌液体培养的因素中筛选出比较重要的影响因素,并实现条件优化,得到最佳营养,优化结果与实际培养情况吻合较好。
通过单因素试验发现长双歧杆菌的最佳碳源为乳糖,低聚木糖、菊糖、低聚异麦芽糖、低聚果糖、苯丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、谷氨酸及赖氨酸能显著促进长双歧杆菌的生长。利用Design Expert 8.06软件进行了主要影响因子筛选和响应面优化,主要影响因子为低聚果糖、菊糖及脯氨酸,优化后的发酵培养基为:将MRS中的碳源葡萄糖替换为乳糖20g/L,再加入低聚木糖1.7g/L、菊糖3.6g/L、脯氨酸0.4g/L和半胱氨酸盐酸盐0.5g/L,37℃厌氧培养18h后其活菌数达(1.75±0.02)×109CFU/mL,比优化前提高了95.64%。
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