美拉德反应对大蒜抗氧化活性的影响

孙月娥，吕丹娜，王卫东，高明侠，*

(1.徐州工程学院食品(生物)工程学院，江苏徐州221111;2.江苏省食品资源开发与质量安全重点实验室，江苏徐州221111)

大蒜(Allium Sativum L.)，别名独蒜、胡蒜等，是百合科葱属一至二年生草本植物。大蒜不但可以作为调味品，而且具有行滞气、暖脾胃、消淤积之功效，是一种良好的药食兼用的植物性食物。但是，大蒜本身带有辛辣味和强烈的刺激性臭味，很大程度上影响了其食疗价值的充分发挥。为了克服大蒜及其制品的缺点，近年来在日本和韩国出现了一种新型大蒜产品，即“黑蒜”(Black Garlic)。它是将完整大蒜(带外皮)在一定条件下经过较长时间的美拉德反应，使整个蒜瓣都呈现出黑色。黑蒜酸甜适口，口感柔软类似果脯，直接食用时很少甚至没有辛辣味，而且食后没有吃生大蒜所特有的蒜臭气味，同时也不会对肠胃产生不良刺激。据报道，黑蒜具有极强的抗氧化活性，可以减少糖尿病的发生，大大提高人体免疫力，并且其生理活性远高于美拉德反应前的新鲜大蒜［1-2］。祝炳俏等［3］分别将黑蒜和白蒜对小鼠灌胃，结果发现黑蒜的抗氧化活性明显高于白蒜。周广勇等［4］研究了黑蒜贮藏期间的抗氧化活性，发现其在贮藏初期是升高的，随着时间的进行在逐渐降低，但仍然高于白蒜的抗氧化活性。目前对老化大蒜提取物的抗氧化活性研究比较多，但是关于黑蒜抗氧化活性的文献报道比较少，并且有研究者将黑蒜与老化大蒜提取物等同［1］。实际上二者的制备方法并不相同，是否具有同样的抗氧化活性还需要进一步研究。本文对黑蒜的多种抗氧化活性进行研究，并初步探讨抗氧化活性与多酚和羟甲基糠醛的关系，为更好的加工高品质的黑蒜提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大蒜 市购;1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)Sigma 公司;硫代巴比妥酸 国药集团化学试剂有限公司;卵磷脂(生物试剂) 成都市科龙化工试剂厂;其他试剂 分析纯。

722G 型分光光度计、PHS-3C 精密pH 计 上海精密科学仪器有限公司;电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;DL-5 低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 黑蒜的制备 新鲜大蒜→挑选→去蒂并剥去外层皮(留下三层皮)→放入密闭容器中于70℃下烘28d。

1.2.2 多酚含量的测定 福林-酚法［5］。

1.2.3 5-羟甲基糠醛(HMF)含量的测定 准确称取3g 的大蒜匀浆于250mL 的三角瓶中，加入30mL70%甲醇，用超声波提取30min，抽滤。滤渣再提取一次，合并提取液并用70%甲醇定容至250mL。取2mL 待测样品2 份于试管中，分别加入5mL 0.1g/mL 对甲基苯胺，在一个试管中加入1mL 70%甲醇作空白溶液，另一试管中加入1mL 5mg/mL 巴比妥酸，测定550nm处的吸光值［6-7］。采用5-HMF 为标准品绘制标准曲线，含量在0～100μg 之间。按照式(1)计算5-羟甲基糠醛的含量:

式中，X 为5-HMF 的含量(μg/g)，A0为空白样中的5-HMF 含量(μg)，Ai为样品中5-HMF 的含量(μg)，V1为样品总体积(mL)，V2为测定所取样品体积(mL)，m 为样品质量(g)。

1.2.4 大蒜乙醇提取物的制备 分别准确称取5g 不同时期的大蒜于250mL 三角瓶中，按料液比1 ∶11(g∶mL)加入70%乙醇，超声(功率40W)提取45min，抽滤。滤液用70%乙醇定容至100mL 后放于冰箱中冷藏备用。

1.2.5 乙醇提取物还原能力的测定 还原能力采用普鲁士兰法测定［8-9］。分别取不同时期的大蒜乙醇提取物0.5mL 于5 支具塞试管中，然后加入0.2mol/L、pH6.6 的磷酸盐缓冲液2.5mL 和1%的铁氰化钾溶液2.5mL，混合均匀，于50℃保温25min 后迅速冷却，加入10%的三氯乙酸溶液2.5mL，混合后以3000r/min离心8～12min。取上清液2.5mL，加2.5mL 蒸馏水和1mL 0.1%的三氯化铁溶液，混合均匀，静置10min后，于700nm 处测定吸光值。吸光值越大，还原能力越强。

1.2.6 乙醇提取物在卵磷脂脂质体中抗氧化能力的测定 采用硫代巴比妥酸法(TBA 法)测定大蒜乙醇提取物的抗氧化性［10］。称取15g 三氯乙酸(TCA)，0.37g 巴比妥酸(TBA)，2.1mL 浓盐酸依次加入100mL 水中，配制为TCA-TBA-HCl 混合液。在具塞试管中依次加入10mg/mL 的卵磷脂磷酸盐缓冲溶液(PBS)1mL、400μmol/L 三 氯 化 铁 溶 液1mL、400μmol/L 抗坏血酸1mL 和大蒜乙醇提取物1mL，混匀后于37℃下避光水浴60min，再加入2mL TCATBA- HCl 混合液，沸水浴10min，迅速冷却后以3000r/min 离心10min，取上清液在532nm 处测吸光值As，空白管以1mL 双蒸水代替1mL 的大蒜乙醇提取物，操作方法同上，测得的即为空白管的吸光值Ac。按式(2)计算大蒜醇提物对脂质体过氧化的抑制率I:

1.2.7 清除羟基自由基能力的测定 采用邻二氮菲-Fe2+自氧化法(Fenton 法)测定［11-12］。移取1mL 2.5mmol/L 的邻二氮菲溶液于具塞试管中，然后分别依次加入2mL pH7.40 的磷酸缓冲溶液和1mL 蒸馏水，充分混匀后，加入1mL2.5mmol/L FeSO4溶液，混匀后，加入1mL 0.01% H2O2溶液，于37℃恒温水浴中反应60min 后，在536nm 迅速测其吸光值，所得的吸光值为损伤管的吸光度A损。以1mL 蒸馏水代替损伤管中的1mL 0.01% H2O2溶液，操作方法同损伤管，即可测得未损伤管的吸光度A未。样品管以1mL大蒜醇提物代替损伤管中的1mL 蒸馏水，可测得样品管的吸光度A样。按式(3)计算大蒜对羟基自由基的清除率I:

1.2.8 清除超氧阴离子自由基能力的测定 邻苯三酚自氧化法［13-15］。于两支具塞试管中分别加入pH8.2 的Tris-HCl 缓冲液(含0.1mmol/L EDTA)3mL，一支试管中加入0.5mL 样液和0.5mL 蒸馏水，另一只试管中加入1mL 蒸馏水作为对照，充分混匀并于25℃保温25min，然后加入40μL 45mmol/L 邻苯三酚溶液，迅速混匀，在325nm 处每隔30s 读取吸光值，反应时间为4min。按式(4)计算大蒜对超氧阴离子的清除率I:

式中ΔA0为加入蒸馏水后的邻苯三酚自氧化速率，即每分钟吸光值的平均变化率，ΔA 为加入大蒜醇提物后的邻苯三酚自氧化速率。

1.2.9 大蒜清除DPPH·能力的测定 按照表1 程序加样，反应30min 后，在517nm 处测定吸光值，按式(5)计算清除率 I，并计算半数抑制率浓度IC50［16-18］:

2 结果与分析

2.1 美拉德反应期间大蒜总酚含量的变化

美拉德反应期间大蒜中总酚含量随时间的变化如图1 所示。由图可见，随着美拉德反应的进行，大蒜中的总酚含量呈上升趋势，28d 时总酚含量为5.4mg/g。大蒜中多酚类物质的主要成分为没食子酸类化合物，在受热过程中，大分子化合物发生分解，生成小分子物质，释放出更多含有酚羟基的化合物，因而使其相对含量得到提高［19］。

表1 清除DPPH 自由基实验加样程序Table 1 Procedure for experiment of scavenging of DPPH·

图1 美拉德反应期间大蒜中总酚含量的变化Fig.1 Changes of total polyphenols in garlic during Maillard reaction

2.2 5-羟甲基糠醛(5-HMF)含量的变化

HMF 是美拉德反应重要的中间产物之一，可以根据5-HMF 的积累程度来反映食品的褐变程度。美拉德反应期间大蒜中5-HMF 含量随时间的变化如图2 所示。由图可见，随着美拉德反应的进行，大蒜中的5-HMF 含量不断增加，28d 时5-HMF 的含量为2729.12μg/g。说明美拉德反应还在进行，没有达到终点。

图2 美拉德反应期间大蒜中5-HMF 含量的变化Fig.2 Changes of 5-HMF in garlic during Maillard reaction

2.3 美拉德反应对大蒜还原力的影响

美拉德反应期间大蒜还原能力随时间的变化如图3 所示。由图可见，随着美拉德反应的进行，大蒜的还原能力不断增加，14d 后增加速度有所减缓，28d时，大蒜的还原力是美拉德反应前的10 倍。前述研究表明，大蒜美拉德反应期间酚类物质含量增加，而酚类物质是抗氧化性很强的物质。此外，美拉德反应产物也具有很强的抗氧化能力，这些物质的含量也是增加的。因此认为酚类物质和美拉德反应产物是导致黑蒜具有比新鲜大蒜更高抗氧化能力的原因之一。

2.4 美拉德反应对大蒜在脂质体中抗氧化能力的影响

图3 美拉德反应期间大蒜还原能力的变化Fig.3 Changes in reducing power of garlic during Maillard reaction

美拉德反应期间大蒜在卵磷脂质体中抗氧化活性随时间的变化如图4 所示。由图可见，随着美拉德反应的进行，大蒜在卵磷脂脂质体中的抗氧化能力呈增强的趋势。美拉德反应28d 后，大蒜在卵磷脂脂质体中的抗氧化能力是起初大蒜的3 倍。大蒜在卵磷脂质体中的抗氧化能力呈上升趋势是由于美拉德反应产物中含有2-呋喃，及含N，S 杂环化合物(呋喃，吡啶，噻吩等)抗氧化物质存在［20］。且随着反应的进行反应的产物会积累，此外酚类物质的增加也是其抗氧化能力增加的原因之一，从而在卵磷脂质体中的抗氧化能力呈增强的趋势。

图4 美拉德反应对大蒜在脂质体中抗氧化能力的影响Fig.4 Effect of Maillard reaction on antioxidant activity of garlic in liposome

2.5 大蒜清除羟基自由基的能力的变化

美拉德反应期间大蒜清除羟基自由基能力随时间的变化如图5 所示。由图可见，随着美拉德反应的进行，大蒜清除羟基自由基的能力不断增加。美拉德反应28d 后，黑蒜清除羟基自由基的能力是普通大蒜的7 倍。羟基自由基的清除率是反映物质抗氧化作用的重要指标之一。清除率越大，表明抗氧化能力越强。大蒜清除羟基自由基的能力的变化与大蒜中总酚含量的变化趋势是一致的。随着反应的进行，大蒜中的酚类物质的增加且酚类物质具有较强的抗氧化能力，从而清除羟基自由基的能力得到提高，另外，有报道认为，清除羟自由基的能力增强与大蒜中的含硒蛋白、含硒多糖等物质的增加也有一定的关系［21］。

2.6 大蒜清除超氧阴离子自由基能力的变化

图5 美拉德反应期间大蒜清除羟基自由基的能力Fig.5 Scavenging activity of garlic against ·OH during Maillard reaction

美拉德反应期间大蒜清除超氧阴离子自由基能力随时间的变化如图6 所示。由图可见，随着反应的进行，大蒜清除超氧阴离子自由基的能力呈增强的趋势。美拉德反应28d 后，黑蒜清除超氧阴离子自由基的能力是普通大蒜的10 倍。超氧自由基的清除率也是反映物质抗氧化作用的重要指标之一。清除率越大，表明抗氧化能力越强。酚类物质的增加是大蒜清除率增加的主要原因之一，美拉德反应产物中具有抗氧化能力的物质也有助于增强其清除率。另外，含硒蛋白、含硒多糖等物质的增加也是原因之一。

图6 美拉德反应期间大蒜清除超氧阴离子自由基的能力Fig.6 Scavenging activity of garlic against O 2- · during Maillard reaction

2.7 大蒜的清除DPPH 自由基能力的变化

美拉德反应期间大蒜的DPPH 自由基IC50值随时间的变化如图7 所示。由图可见，随着美拉德反应的进行，大蒜清除DPPH 自由基IC50呈下降的趋势。美拉德反应28d 后，黑蒜清除DPPH 自由基的能力是普通大蒜的50 倍。DPPH 自由基IC50值是反映物质抗氧化性能的指标之一，IC50值越大，表明物质的抗氧化性能越强。即随着美拉德反应时间的增加，大蒜的清除DPPH 自由基的能力越来越强。大蒜清除DPPH 自由基IC50呈下降的趋势可能是由于随着反应的进行大蒜中的酚类物质、含硒蛋白、含硒多糖及美拉德反应产物等具有抗氧化活性物质的增加。

图7 美拉德反应期间大蒜清除DPPH·的能力Fig.7 Scavenging activity of garlic against DPPH· during Maillard reaction

3 结论

美拉德反应提高了大蒜的抗氧化能力，较白蒜都有了很大的提高。黑蒜的还原能力、在卵磷脂脂质体中的抗氧化能力、羟基自由基的清除率、超氧阴离子自由基的清除率、及DPPH·的IC50值依次是普通大蒜的10、3、7、10、50 倍。黑蒜的抗氧化能力的增加在一定程度上与其含有的总酚和美拉德反应产物的增加有关。

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