响应面优化西红花中西红花苷提取工艺的研究

曹佳佳，申屠超2，，侯晓蓉，单伟光，*

(1.浙江工业大学药学院，浙江杭州310032;2.浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江杭州310015)

西红花为鸢尾科植物番红花(Crocus sativus L.)的干燥柱头，有“植物黄金”之称。西红花的主要有效成分西红花酸和西红花苷有抗炎镇痛、抗肿瘤、抗抑郁、降糖、降血压等多种药理活性［1-4］。另外，西红花也是调节气血、实现气血均衡的美容保健食品［5］。西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ作为西红花的质控指标被记载于《中国药典》(2010 版)中，且规定其总含量不得少于10.0%(按照干燥品计算)。目前，响应面优化法在中草药有效成分的提取中应用较为广泛［6-9］，它以相对较少的实验组数对实验过程的影响因子及其交互作用进行评价，确定其最佳提取工艺条件。但目前国内外对西红花中西红花苷的提取工艺报道甚少［10-11］，且未见有关响应面法优化西红花中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ提取工艺的报道。因此，本研究在对提取西红花中西红花苷-I 和西红花苷-II 的单因素实验基础上，应用响应面法对提取工艺参数进行优化，为西红花中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的提取提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

西红花苷-Ⅰ(crocin-Ⅰ，纯度＞97%) 成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-11071108;西红花苷-Ⅱ(crocin-Ⅱ，纯度＞98%) 成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-11091002;西红花样品① 2010 年采自南汇;西红花样品② 2013 年采自海门;甲醇 色谱级，TEDIA 公司;乙醇 分析级，安特公司。

Agilent 1200 高效液相色谱仪 安捷伦科技有限公司;电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;KQ5200DE 型数控超声清洗仪 昆山超声仪器有限公司;真空干燥箱 上海森信实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 西红花苷的提取方法 将西红花药材粉碎并过50 目筛，置真空干燥箱，室温减压干燥24h，精确称取10mg 于25mL 棕色容量瓶中，加入20mL 50%乙醇，在45℃下超声提取(超声功率100W)西红花苷30min，冷却至室温后用50%乙醇定容，摇匀过滤后测定西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的含量。

1.2.2 提取工艺最优参数的确定 在单因素实验确定了乙醇浓度为50%、提取时间为30min 和提取温度为40℃的基础上，以西红花中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的得率作为评价指标进行分析研究，并确定三因素三水平的最佳参数进行响应面的分析。实验设计中因素和水平见表1。

表1 响应面实验的因素和水平Table 1 Experimental factors and levels used in response surface analysis

1.2.3 西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ得率的测定 采用高效液相色谱法测定西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的含量［12-13］。色谱柱:Agilent ZORBX SB-C18(4.6mm× 150mm，5μm);流动相:甲醇-水(45 ∶55);流速:1.0mL/min;检测波长:440nm;柱温:30℃;进样量:10μL。用标准曲线法测定西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的含量。西红花苷(Ⅰ，Ⅱ)得率的计算公式:西红花苷(Ⅰ，Ⅱ)(%)=提取的西红花苷(Ⅰ，Ⅱ)质量(mg)/西红花样品的总质量(mg)×100。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 乙醇浓度对提取的影响 西红花样品①提取过程中控制体系温度30℃、提取时间30min，分别加入10%、30%、50%、70%、90%乙醇进行超声提取。乙醇浓度对西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ提取的影响见图1。由图1 可见，乙醇浓度10%～50%范围时，西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ得率随着乙醇浓度增加而增加;乙醇浓度大于50%时，西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ得率开始减少(西红花苷-Ⅱ的变化较缓慢)。因此，确定提取西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ最佳乙醇浓度为50%。

图1 乙醇浓度对西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of crocin-Ⅰand crocin-Ⅱ

2.1.2 提取时间对提取的影响 西红花样品①提取过程中控制乙醇浓度50%、提取温度30℃，设置提取时间分别10、20、30、40、50min。提取时间对西红花苷得率的影响见图2。由图2 可见，在20min 内，西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ得率基本上保持不变，在20～30min 间西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ提取效率随着提取时间的增加而提高;而在30min 后又开始缓慢下降，可能是长时间超声波的热效应导致西红花苷分解［14］，故选择提取时间为30min。

图2 提取时间对西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of crocin-Ⅰand crocin-Ⅱ

2.1.3 提取温度对提取的影响 西红花样品①提取过程中控制乙醇浓度50%、超声时间30min，分别选择提取温度0、10、20、30、40、50℃超声提取。提取温度对西红花苷得率影响结果见图3。由图3 可见，在0～40℃时西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ得率随着温度的升高而缓慢增加，当温度达到40℃时，西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的得率达到峰值随后又开始下降，为了避免温度过高使西红花苷分解，故提取温度选择40℃为宜。

图3 提取温度对西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ得率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of crocin-Ⅰand crocin-Ⅱ

2.2 响应面法优化西红花苷的提取条件

2.2.1 响应面设计方案与实验结果 参考单因素实验结果，以乙醇浓度、提取时间、提取温度为主要因素进行对西红花样品②响应面分析实验。根据Box-Benhnken中心组合设计原理，选择用3 水平的响应面分析实验，即为3 因素3 水平，共有12 个实验点，加上5 个中心实验点，共17 个实验点，其中心点重复实验用来评估实验误差。实验设计与结果见表2。

表2 Box-Behnken Design 实验设计与结果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 西红花苷-Ⅰ的方差分析及显著性检验Table 3 Results of variance analysis and significance test of crocin-Ⅰ

2.2.2 模型的建立及显著性检验利用Design expert 8.0 统计软件设计实验因素乙醇浓度、提取时间、提取温度，根据表实验数据进行回归拟合，得到由编码因素组成的回归方程如下:

式中:Y1，Y2 分别代表测定的西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ含量，A、B、C 各自代表乙醇浓度、提取时间和提取温度。对该模型数据进行方差分析和显著性检验，结果见表3 和表4。

由表3，表4 回归分析结果可见，西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ实验模型显著(p ＜0.05)，拟合项p ＞0.05 不显著，说明该模型拟合程度良好，实验误差小，变异系数较低，即该模型可以用于西红花中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ实际提取工艺的预测。各因素的p 值可以反映各因素对实验指标的重要性，由p值可知二次项A(乙醇浓度)、B(提取时间)对西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的响应值影响显著，即各因素对西红花苷的提取率不是单一的线性关系。

2.2.3 响应面分析与优化西红花苷的提取工艺 响应面图可直观的反映出各个因素和各个因素之间的交互作用，通过多元回归方程做出响应面，分析乙醇浓度、提取时间和提取温度对西红花苷得率的影响，见图4～图6。

图4 乙醇浓度和提取时间对西红花苷得率影响的响应面图Fig.4 Effect of ethanol concerntration and extracting time on crocin extracting rate in resoponse surface

表4 西红花苷-Ⅱ的方差分析及显著性检验Table 4 Results of variance analysis and signifcance test of crocin-Ⅱ

图5 乙醇浓度和提取温度对西红花苷得率影响的响应面图Fig.5 Effect of ethanol concerntration and extracting temperature on crocin extracting rate in resoponse surface

乙醇浓度和提取时间的交互作用如图4 所示，当乙醇浓度40%时，随着提取时间的增加，西红花苷的得率呈现先增大后减少的趋势。当提取时间为30min 左右时，西红花苷的的提取率达到最大值。乙醇浓度和提取温度的交互作用如图5 所示，当提取温度较低时，随着乙醇浓度的增加，西红花苷的得率呈现先增大后减少的趋势。当乙醇浓度达50%左右时，西红花苷的得率达到最大值。提取时间和提取温度的交互作用如图6 所示，在较短提取时间下，西红花苷的得率随着提取温度的增加而缓慢增加。因此，适当地提高温度、调节乙醇浓度和提取时间有利西红花苷的提取。

2.3 西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ提取工艺条件的验证

图6 提取时间和温度对西红花苷得率影响的响应面图Fig.6 Effect of extracting temperature and time on crocin extracting rate in resoponse surface

通过对二元二次方程进行偏微分，用Designexpert 软件对实验模型进行典型性分析，综合各种因素，获得最佳提取工艺参数为:乙醇浓度为49.32%、提取温度为46.32℃、提取时间为30.86min。以50%乙醇、45℃超声提取西红花苷30min(超声功率100w)，平行实验3 次，西红花样品②所提取的西红花苷- Ⅰ和西红花苷- Ⅱ含量分别为14.12% 和4.98%，其理论预测值分别为14.22%、5.05%，实际提取率分别达理论预测值的99.3%和98.6%。实验表明该模型优化西红花中西红花苷的提取工艺是可行的。

3 结论

本实验在单因素实验基础上，将响应面应用于西红花中有效成分西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ提取工艺优化，通过响应面分析，西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的最佳提取工艺参数是乙醇浓度50%、提取时间30 min、提取温度45℃。在此优化的提取工艺条件下，西红花样品②中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ得率分别为14.12% 和4.98%。本提取工艺具有操作简便快速、提取率高及所用溶剂环保等优点，可应用于西红花中有效成分西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的提取，有重要的实用价值。

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