CCR7基因rs3136685多态性与中国北方汉族人群冠心病的关系

蔡文芝，张效林，冯雪瑶，白净，刘腾飞，汪洁，韩雅玲

·临床研究·

CCR7基因rs3136685多态性与中国北方汉族人群冠心病的关系

蔡文芝，张效林，冯雪瑶，白净，刘腾飞，汪洁，韩雅玲

目的探讨趋化因子CCR7基因单核苷酸多态位点rs3136685多态性与中国北方汉族人群冠心病的关系。方法连续收集2010年3月－2011年12月沈阳军区总医院心内科住院患者578例，其中病例组(经冠状动脉造影证实一支或多支血管狭窄50%以上)287例，对照组(冠状动脉造影正常且没有其他粥样硬化证据)291例。冠心病组根据血管病变支数分为3个亚组：单只病变组(n=104)，双支病变组(n=89)和3支病变组(n=94)。提取患者血液白细胞基因DNA，采用直接测序法测定趋化因子CCR7基因rs3136685单核苷酸多态位点的基因型，并进行基因型和等位基因与冠心病及冠心病病变程度的相关性分析。结果CCR7基因rs3136685单核苷酸多态性共检测到3种基因型，即GG型、AG型和AA型，在病例组的分布频率分别为42.9%、45.6%、11.5%，在对照组分别为43.0%、44.3%、12.7%，两组基因型分布皆符合Hardy-Weinberg平衡定律，3种基因型在两组间的分布差异无统计学意义(P＞0.05)。A等位基因在病例组及对照组的分布频率分别为34.3%、34.9%，差异亦无统计学意义(P＞0.05)。亚组分析显示，CCR7基因rs3136685单核苷酸多态性的基因型和等位基因频率在单支病变、双支病变及3支病变3个亚组间差异无统计学意义(P＞0.05)。结论CCR7基因rs3136685单核苷酸多态性与中国北方汉族人群冠心病的发病及疾病严重程度可能无相关关系。

炎症趋化因子类；多态性，单核苷酸；冠状动脉疾病

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病(coronary artery disease，CAD)的病理基础，目前被认为是动脉壁的一种慢性炎性，其早期阶段的特点是血管内皮损伤，血小板黏附、聚集以及单核细胞募集至血管壁[1]。单核细胞吞噬氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)后分化为巨噬细胞，并分泌各种炎症介质，吸引更多的单核细胞、T细胞和B细胞进入AS部位[2-3]，最终引起AS斑块不稳定和破裂，阻断正常血流，导致心绞痛和心肌梗死的发生[3]。

目前研究表明，炎症细胞向血管壁的募集依赖于趋化因子及其相应G蛋白质偶联受体[4]，单核细胞、中性粒细胞和T细胞向AS斑块迁移分别由趋化因子受体CCR2/CCR5/CCR6/CX3CR1、CXCR2/ CXCR4和CCR5/CXCR3介导[4]。CCR7是一种趋化因子受体，其配体为CCL19和CCL21，研究发现CCR7在人类和小鼠的AS斑块中大量表达[5]，表明其可能参与AS的发展，并造成斑块不稳定。CCR7基因单核苷酸多态位点rs3136685是CCR7基因内含子区的G/A突变，目前尚少见其与CAD相关关系的研究报道。本研究旨在观察CCR7基因rs3136685多态是否为中国北方汉族人群CAD的遗传危险因素。

1 资料与方法

1.1一般资料 连续收集2010年3月－2011年12月沈阳军区总医院心内科住院的CAD患者287例(病例组)，其中男176例，女111例，年龄29～70(56.8±6.2)岁；另选291例因胸痛入院但没有血管疾病、冠脉主支没有狭窄的患者为对照组，其中男127例，女164例，年龄56.5±7.0岁。所有入选者均为汉族，无血缘关系，来自于中国东北地区，在沈阳军区总医院接受冠状动脉造影检查。CAD诊断标准：冠脉造影证实左前降支、左回旋支、右冠状动脉及主要分支中至少一支主要冠脉动脉狭窄达50%以上。另根据冠脉造影显示所累及血管数将病例组分为单支病变(n=104)、双支病变(n=89)和3支病变(n=94)3个亚组。排除标准：患有肝脏、肾脏、甲状腺、血液系统疾病及肿瘤的患者；存在炎症、感染或自身免疫系统疾病、1型糖尿病及家族性高脂血症的患者。

1.2基因组DNA提取及基因型分析 空腹抽取静脉血5m l，EDTA抗凝，采用血液基因组DN A提取试剂盒(沈阳立信生物科技有限公司)提取DNA。以聚合酶链反应(po lym erase chain reac tion，PCR)扩增rs31366858位点及其侧翼区。采用Gene Runner 5.0设计引物(正义5'-ATCTCTGGTCCAGGAAGAAG-3'，反义5'-TCTCATTGCTCGAAGGTG-3'，产物大小322bp，上海生物工程有限公司合成)。50μl PCR反应体系包括2×TaqMasterM ix 25μl、上下游引物各2μl、基因组DNA 2μl、去离子水19μl。扩增反应在PCR热循环仪(Bio-Rad，USA)中完成，扩增条件：94℃预变性4m in；94℃ 30s、57℃ 30s、72℃ 30s，30个循环；72℃延伸7m in。产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，150V电压下电泳30m in，凝胶成像系统检测PCR扩增产物。SNP检测：将目的DNA片段送上海生工生物工程有限公司进行焦磷酸测序。

1.3统计学处理 采用SPSS 17.0软件包进行分析。以Hardy-Weinberg平衡定律检测样本的群体代表性。计数资料如基因型和等位基因频率采用基因直接计数法计算，各组间基因型及等位基因频率比较采用四格表χ2检验，基因多态性与疾病的关系分析采用logistic回归分析。计量资料以±s表示，各组间比较依据资料的性质，采用t检验或方差分析。检验水准为α＝0.05。

2 结 果

2.1一般资料 两组间年龄及糖尿病、高血压构成差异均无统计学意义(P＞0.05，表1)。

2.2rs3136685单核苷酸多态位点分布 CCR7基因rs3136685多态位点PCR扩增产物片段长度为322bp。经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，上海生工生物工程有限公司对目的片段进行焦磷酸测序，结果显示CCR7基因rs3136685为AG多态，存在GG型、AG型及AA型3种基因型(图1)。

表1 两组一般资料Tab. 1 Demographic and clinical data of patients involved

图1 CCR7基因rs3136685单核苷酸多态测定结果Fig.1 The polymorphism of CCR7 rs3136685 mononucleotide

2.3rs3136685基因型及等位基因分析 病例组和对照组均处于Hardy-Weinberg平衡状态(χ2分别为0.05和0.17，P＞0.05，表2)。两组基因型分布情况为：病例组GG型123例(42.9%)、AG型例131(45.6%)、AA型33例(11.5%)，对照组GG型125例(43.0%)、AG型129例(44.3%)、AA型37例(12.7%)。两组各基因型分布差异无统计学意义(χ2=0.23，P=0.91)；G、A等位基因在两组间的分布差异无统计学意义(χ2=0.04，P=0.84)。基因型和等位基因分布经logistic回归分析，校正性别和各冠心病危险因素后P值分别为0.87、0.78，差异仍无统计学意义(表3)。

表2 两组rs3136685位点基因型Hardy-Weinberg平衡检验Tab. 2 Hardy-Weinberg equilibrium test of rs3136685 genotype in patients involved

表3 两组rs3136685位点基因型分布和等位基因频率Tab.3 Genotype and allele frequency of rs3136685 in patients involved

2.4rs3136685多态性与冠脉病变程度之间的关联分析 3个亚组中rs3136685基因型的分布情况如下：单支病变组GG型44例(42.3%)、AG型48例(46.2%)、AA型12例(11.7%)；双支病变组GG型37例(41.6%)、AG型42例(47.2%)、AA型10例(11.2%)；三支病变组GG型42例(44.7%)、AG型41例(43.6%)、AA型11例(11.7%)。A等位基因在3组间的分布分别为72例(35%)、62例(34.8%)、63例(33.5%)。3组各基因型分布差异无统计学意义(χ2=0.30，P=0.99)，G、A等位基因分布差异亦无统计学意义(χ2=0.11，P=0.95，表4)。3组间基因型和等位基因两两比较差异均无统计学意义。

3 讨 论

AS是一种慢性炎性疾病，其发生发展与机体的免疫系统功能有关[2,6]。CCR7是被认为是一种重要的维护机体适应性免疫系统稳态的趋化因子受体，可激活T细胞和树突细胞(DCs)，并能够调节T细胞向淋巴结的归巢[7-8]。研究发现，CCR7及其配体CCL19和CCL21均在AS斑块中高表达[5]，CCR7基因敲除后小鼠AS斑块形成明显减缓[9]，表明CCR7在AS发展中是一个至关重要的因素。

CAD已经被证实是一种遗传及环境等多种因素共同作用的多基因遗传性疾病[10-11]。随着分子生物学技术的发展，基因多态性在CAD发生发展中的作用已成为研究热点[12]。CCR7基因定位于17号染色体q12-q21.2，全长为11 702bp，含有3个外显子，2个内含子，编码378个氨基酸。HapMap中国人群数据库已完成Ⅱ期，其最小等位基因频率(m inor allele frequency，MAF)已达到5%水平，足够进行基于“常见疾病-常见变异”的复杂疾病的关联研究。在CCR7基因及基因两侧各2.0kb的区域，以r2=0.8、MAF＞0.05进行配置，共选择出4个标签SNP，均位于内含子区。内含子为基因的非编码区，越来越多的证据表明真核生物内含子具有一定的生物学功能[13]，内含子区的基因变异会影响基因拼接[14]并可导致疾病的发生[15]。本研究选择CCR7基因rs3136685 SNP进行与CAD及CAD病变程度的关联分析，旨在早期预测CAD及其病变程度，同时为个体化合理用药、减少各种不良心血管事件的发生提供更多的临床依据。

表4 rs3136685多态性与冠脉病变程度之间的关联分析Tab. 4 Association analysis between rs3136685 genotype polymorphism and the angiographic severity of CAD

在本研究中GG、GA、AA三种基因型均存在，Hardy-Weinberg平衡检验提示来自同一孟德尔群体，人群选择无偏倚，这消除了因人群偏倚产生的假阳性或假阴性结果。结果显示，两组人群rs3136685多态位点基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义，经logistic回归分析校正性别及各冠心病危险因素后亦未发现rs3136685多态与CAD和CAD病变程度存在相关关系。这可能是因为rs3136685多态位于CCR7的内含子区，不影响CCR7蛋白的转录、翻译，且不影响基因拼接，故而对CAD的发病无影响。本研究仅入选了287例CAD患者和291例对照进行单核甘酸多态性分析，样本量较小，也不能排除因此产生的假阴性结果，因而需要更大样本量的病例-对照研究。进一步的工作应该继续筛选CCR7启动子区、外显子区及3'UTR区的标签SNP，采用更大样本量及复制实验更加深入地研究CCR7基因多态性与冠心病及其病变程度之间的关系。

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Relation ship between CCR7 rs3136685 polymorphism and coronary arteryd isease in Han population in north China

CAI Wen-zhi1, ZHANG Xiao-lin2, FENG Xue-yao2, BAI Jing2, LIU Teng-fei1, WANG Jie2, HAN Ya-ling2*
1Post-graduate School of Liaoning Medical College, Jinzhou, Liaoning 121000, China
2Department of Cardiovascular Disease, General Hospital of Shenyang Military Command, Shenyang 110840, China
*

, E-mail: yalinghan1120@126.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81100135), and the Major High-teach Clinical ArmyProjects (2010GXJS001)

ObjectiveTo explore the relationship between the polymorphism of CCR7 rs3136685 and the coronary artery disease (CAD) in Han population in north China.MethodsA total of 578 cases (including 287 patients with CAD and 291 control individuals) adm itted to General Hospital of Shenyang military Command from Mar. 2010 to Dec. 2011 were enrolled in the present study. All the subjects were unrelated individuals of Chinese Han inhabited in the northeast area of China, and had undergone coronary angiography. Those with 50% or more angiostenosis in one or more coronary arteries were sorted out as CAD group, which were then divided in 3 subgroups: namely angiostenosis in one vessel (n=104), in two vessels (n=89) and in three vessels (n=94). Those with normal angiography and no evidence of atherosclerosis were grouped as controls. Genom ic DNA was extracted from blood leukocytes and polymorphic genotypes were determined by polymerase chain reaction and sequencing analysis. The correlation of rs3136685 genotype and allele frequency to CAD and the angiographic severity of CAD were analyzed. ResultsThree genotypes (GG, AG and AA) were detected in CCR7 rs3136685 genetic locus, their frequencies were 42.9%, 45.6% and 11.5%, respectively, in CAD group; and 43.0%, 44.3% and 12.7%, respectively, in control group (P＞0.05). The distribution of the 3 genotypes in the both groups was coincident with the law of equilibrium. The distribution frequencies of A allele in CAD group and control group were 34.3% and 34.9% respectively, with no significant difference (P＞0.05). Further stratification analysis among the polymorphism of CCR7 rs3136685 and angiographic severity of CAD also yielded negative results (P＞0.05).ConclusionTheCCR7 rs3136685 polymorphism is unlikely to be a major contributor to the pathogenesis of CAD in Han population in north China.

chemokines; polymorphism, single nucleotide; coronary disease

R541.4

A

0577-7402(2013)07-0561-04

2013-02-29

2013-04-26)

(责任编辑：张小利)

国家自然科学基金青年科学基金项目(81100135)；军队临床高新技术重大项目(2010GXJS001)

蔡文芝，硕士研究生。主要从事冠心病的治疗及基础研究

121000 辽宁锦州 辽宁医学院研究生学院(蔡文芝、刘腾飞)；110840 沈阳 沈阳军区总医院心内科(张效林、冯雪瑶、白净、汪洁、韩雅玲)

韩雅玲，E-mail：yalinghan1120@126.com