FGFR2功能获得性突变对长骨发育过程的影响

陈鹏，张波，张莉，张连阳

FGFR2功能获得性突变对长骨发育过程的影响

陈鹏，张波，张莉，张连阳

目的对比观察Fgfr2+/S252W突变型小鼠和同窝野生型小鼠长骨的生长发育情况，探讨FGFR2功能持续增强对软骨内成骨过程的影响。方法采用经基因敲入技术建立的模拟人Apert综合征的Fgfr2+/S252W小鼠模型，经繁殖、鉴定后分为Fgfr2+/S252W功能获得突变型和同窝野生型。于出生后7、10、14、28d分别处死突变型和野生型小鼠各3只，对长骨进行长度测量、X线检查及M icro CT检查，另取部分长骨标本进行HE染色和免疫组化染色观察。结果Fgfr2+/S252W突变小鼠呈典型Apert综合征圆颅和短颅畸形，体形发育缓慢，体长、四肢长度明显小于同窝野生小鼠，且长骨发育障碍，第二骨化中心延迟出现，骨密度及骨小梁数量低于同窝野生型小鼠。组织学观察可见突变小鼠胫骨近端生长板软骨细胞增殖区和肥大区厚度缩短，细胞排列不及野生型整齐，肥大软骨细胞体积小，免疫组化检测显示软骨相关增殖、分化基因表达均减弱。结论FGFR2功能持续增强可导致小鼠长骨发育障碍。FGFR2可能具有调控成骨细胞系及软骨细胞系发育的功能，在骨骼发育等方面发挥重要作用。

受体，成纤维细胞生长因子，2型；尖头并指(趾)畸形；软骨发生；骨生成

骨生成主要通过软骨内成骨和膜内成骨两种方式，其中长骨发育以软骨内成骨为主。Apert综合征是一种颅缝早闭疾病，由2型成纤维细胞生长因子受体(fibroblast grow th factor receptor 2，FGFR2)的功能增强型点突变引起，患者表现为冠状缝早闭，四肢短小畸形和并指/趾[1-2]。既往研究显示FGFR2主要调控骨发育的成骨过程[3-4]，而其对软骨内成骨的影响研究甚少。有研究显示，长骨骺端软骨组织中存在FGFR2的表达，且FGFR2功能增强可导致颅底软骨发育障碍[5]，结合Apert综合征患者四肢发育畸形的表现，推测FGFR2可能在软骨组织的生长发育过程中发挥一定的调控作用。本实验采用经基因敲入(knock in)技术建立的模拟人Apert综合征的Fgfr2+/S252W小鼠模型，对比观察同窝野生型和FGFR2获得性增强突变型小鼠的长骨发育情况，以探讨FGFR2功能增强能否影响软骨内成骨过程，从而影响整个长骨的发育。

1 材料与方法

1.1动物来源 将从美国NIH引进的雄性带neo基因+突变FGFR2的基因工程小鼠[6]、雄性EII-Cre小鼠分别与雌性C57BL/6J小鼠(2～4月龄)交配，得到的F1代经鉴定带neo基因+突变FGFR2的基因小鼠，将其与F1代EII-Cre小鼠再次交配，EII-Cre启动子去掉FGFR2-neo-S252W的neo基因，在子代中获得约1/4数量的Fgfr2+/S252W功能获得性突变小鼠。对小鼠进行基因型鉴定，按照基因型分为野生型和突变型(Fgfr2+/S252W)两组，每组中每个检测时间点3只。EII-Cre、C57BL/6J小鼠由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供。所有小鼠均为SPF级，在实验过程中由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心饲养。

1.2主要仪器与试剂 台式高速冷冻离心机(Sigm a，Germ any)，PCR仪(GeneAm p，Hong Kong)，电泳仪、凝胶成像系统(Bio-Rad，USA)，数字X线摄影机(LORAD，USA)，M icro CT(Scanco M ed ical，Sw itzer land)，组织切片机(Leica，Germany)，显微镜(O lympus，Japan)，Spot内置彩色数码相机(Diagnostic Instruments，USA)。蛋白酶K(Roche，USA)，EDTA粉(上海生物工程有限公司)，胶原Ⅱ(Col Ⅱ)、胶原Ⅹ(Col Ⅹ)、抗体(Santa Cruz，USA)，即用型SABC免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3Fgfr2+/S252W小鼠基因型的鉴定[6]剪取小鼠尾巴，长约2mm，用含100mg/L蛋白酶K的组织裂解液56℃裂解12h，提取基因组DNA。用以下引物进行扩增：①带neo基因+突变FGFR2小鼠。R2-7R2：5'-TTGATCCACTGGATGTGGGGC-3'；RINA：5'-CCAGACTGCCTTGGGAAAAGC-3'。②EII-Cre小鼠。C1：5'-GCCTGCATTACCGGTCGATGC-3'；C 2：5'-CAGGGTGTTATAAGCAATCCC-3'。③Fgfr2+/S252W小鼠。R2I6F1：5'-TAGGTAGTCCA TAACTCGG-3'；R2-7R2：5'-TTGATCCACTGGATG TGGGGC-3'。PCR产物凝胶电泳后，根据条带对小鼠进行区分(图1)。

图1 基因鉴定电泳图Fig. 1 PCR electrophoresis image of gene identification

1.4标本取材 对同窝出生的小鼠根据鉴定结果分为野生组和突变组，两组分别取7、10、14、28d龄小鼠(每组每时间点3只)，采用颈椎脱臼法处死，留取下肢作为标本进行实验。

1.5小鼠骨骼X线检测 采用美国LORAD公司的钼靶X线机(型号Selenia)对同窝野生型和突变型小鼠进行X线摄像(参数为电压32kV，曝光时间10ms)，初步观察两种基因型小鼠下肢骨形态及骨皮质密度、骨小梁情况等指标。

1.6小鼠股骨M icro CT扫描 采用瑞士Scanco Medical小动物M icro CT扫描仪对小鼠股骨进行扫描及三维重建。将股骨周围软组织清除干净，70%乙醇固定过夜后，垂直于水平面放入样品管中进行扫描。扫描参数为电压70kV，电流113μA，中分辨率(20μm)。

1.7组织病理学观察 胫骨取材后经4%多聚甲醛固定3d，10% EDTA脱钙3周，常规石蜡包埋、切片(厚6μm)，HE染色，封固，光镜下观察长骨生长板软骨组织的增殖、分化情况。

1.8免疫组织化学染色观察 石蜡切片脱蜡、水化，3%H 2O2室温孵育10m in，PBS漂洗后山羊血清封闭30m in，加入一抗(Col Ⅱ、Col Ⅹ)4℃过夜，PBS漂洗后加入适量二抗工作液(37℃、45m in)，再次PBS漂洗后加辣根酶标记链霉卵白素工作液(37℃、30m in)，PBS漂洗后，DAB显色5m in，自来水冲洗，脱水，封固，光镜下观察。

1.9统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据结果以表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两组小鼠生长发育情况 肉眼观察显示，Fgfr2+/S252W小鼠从出生时整个体形即小于同窝野生型小鼠，且行动迟缓，反应迟钝。出生后1周左右，Fgfr2+/S252W小鼠逐渐显现出异常的头颅形态，随时间延长，头颅的纵向短缩更加明显，类似人类Apert综合征颅骨表型，即圆颅和短颅畸形，中脸纵向发育不良，而横径增加，伴下切牙开始向前增长。Fgfr2+/S252W小鼠体形发育缓慢，体长、四肢长度明显短于同窝野生小鼠，呈侏儒表型，但未发现并指/趾畸形[7](图2)。2.2两组小鼠长骨发育的X线表现 对同窝野生型和Fgfr2+/S252W突变小鼠进行下肢X线摄像检查发现，突变小鼠各时间点的下肢骨长度明显短于同窝野生型小鼠(表1)。由图3可见，在发育过程中，Fgfr2+/S252W小鼠肢体长度短于野生型小鼠，且骨皮质光密度偏低，干骺端骨小梁稀疏；在干骺端软骨骨化过程中，野生型小鼠10d左右出现第二骨化中心，而Fgfr2+/S252W小鼠未出现第二骨化中心，提示其存在软骨内成骨障碍。

图2 Fgfr2+/S252W和野生型小鼠生长发育情况Fig. 2 Body and skull development of Fgfr2+/S252W(MT) and w ild type (WT) m ice

表1 Fgfr2+/S252W和野生型小鼠下肢骨长度比较(mm，±s，n=3)Tab. 1 Comparison of femur and tibia length between mutant type (MT) and w ile type (WT) m ice (mm,±s,n=3)

表1 Fgfr2+/S252W和野生型小鼠下肢骨长度比较(mm，±s，n=3)Tab. 1 Comparison of femur and tibia length between mutant type (MT) and w ile type (WT) m ice (mm,±s,n=3)

(1)P＜0.001 compared with WT

Location 7d 10d 14d 28d WT MT WT MT WT MT WT MT Femur 4.70±0.13 3.88±0.16(1)6.52±0.15 5.40±0.17(1)8.59±0.18 7.16±0.17(1)11.19±0.17 9.46±0.17(1)Tibia 6.38±0.10 5.12±0.14(1)8.60±0.15 7.21±0.14(1)11.04±0.18 9.59±0.16(1)15.10±0.24 12.88±0.21(1)

图3 Fgfr2+/S252W和野生型小鼠长骨发育的X线结果比较Fig. 3 X-ray examination of long bone development in mutant type (MT) and wile type (WT) mice

2.3两组小鼠长骨干骺端发育的M icro CT观察 采用M icro CT对4周龄的小鼠干骺端骨小梁进行扫描发现，Fgfr2+/S252W小鼠骨组织含量明显低于同窝野生型小鼠，且股骨干骺端骨小梁明显减少、稀疏(图4)。

2.4两组小鼠长骨发育的组织学观察 由图5可见，HE染色显示，发育至第7天，Fgfr2+/S252W小鼠长骨生长板软骨细胞基本呈柱状排列，但不及野生型排列整齐，且肥大软骨细胞体积较小，软骨细胞增殖区和肥大区缩短；发育至第10天，野生型小鼠胫骨出现第二骨化中心，而Fgfr2+/S252W小鼠长骨第二骨化中心未出现；发育至第4周，Fgfr2+/S252W小鼠胫骨干骺端骨小梁稀疏，且骨小梁长度缩短，与X线、M icroCT检查结果一致。

2.5两组小鼠胫骨生长板Col Ⅱ、Col Ⅹ的表达免疫组化染色显示，发育至第5天，Col Ⅱ主要在生长板增殖层软骨表达，而Col Ⅹ在生长板肥大层软骨表达。与野生型小鼠比较，Fgfr2+/S252W小鼠生长板软骨Col Ⅱ、Col Ⅹ免疫组化染色颜色淡，增殖层、肥大层阳性细胞数量少(图6)。

图4 4周龄Fgfr2+/S252W和野生型小鼠干骺端M icro CT扫描结果Fig. 4 M icro CT image of femur metaphysis in mutant type (MT) and wile type (WT) mice, 4 weeks after birth

图5 Fgfr2+/S252W和野生型小鼠胫骨干骺端组织形态比较(HE ×100)Fig. 5 Comparison of tibia metaphysis in mutant type (MT) and wile type (WT) mice (HE ×100)

图6 5日龄Fgfr2+/S252W和野生型小鼠胫骨近端生长板软骨Col Ⅱ、Col Ⅹ的表达(免疫组化 ×100)Fig. 6 Col Ⅱ and Col Ⅹ expression in tibia grow th plate of mutant type (MT) and w ile type (WT) m ice 5 days after birth (Immunohistochemistry ×100)

3 讨 论

FGFR属于受体酪氨酸蛋白激酶(recep to r tyrosine kinase，RTK)家族，包括FGFR1、2、3、4共4种受体，它们通过与FGF结合发挥生物学功能。近年来研究发现FGF信号与骨骼发育有密切关系[1,8]。

既往研究认为，在软骨内成骨过程中发挥调控作用的FGFR主要是FGFR3，可在胚胎发育形成骨化中心前对增殖和前肥大软骨细胞进行调控，对软骨发育起到负性调节作用[9-11]，而FGFR2主要调节成骨细胞发育，可调控位于软骨膜、骨膜和颅缝处的前骨生成细胞和骨生成细胞的增殖及分化[4]。虽然已有少数研究在软骨细胞系(尤其是成熟的软骨细胞中)检测到FGFR2的表达[12-14]，并发现其在颅底软骨发育中具有重要作用[5]，但迄今为止FGFR2在骨骼发育过程中对软骨内成骨的调控作用研究甚少。

应用基因敲入技术建立的FGFR2功能获得型基因突变小鼠，其FGFR2功能增强，表现出类似人Apert综合征的骨骼表型。除了颅缝早闭、圆颅畸形外，还存在体形减小及四肢短缩畸形[6-7,15]，因长骨的生长是软骨内成骨过程，而该模型小鼠表现为软骨内成骨发育不良，故考虑FGFR2功能持续增强可能与软骨内成骨发育障碍有关。

本研究发现Fgfr2+/S252W小鼠在出生后发育早期体格较野生型弱小，四肢短缩。出生10d左右，突变型小鼠长骨第二骨化中心未出现，且骨发育过程中骨密度、骨小梁厚度明显低于同窝野生小鼠。组织学观察显示，Fgfr2+/S252W小鼠长骨生长板软骨增殖区和成熟肥大区细胞排列并未出现类似FGFR3功能增强模型小鼠软骨细胞杂乱无序的排列[16]，但其软骨细胞体积缩小，增殖、肥大带厚度缩短，提示FGFR2功能持续增强可能抑制软骨细胞增殖、分化，导致长骨软骨内骨化障碍，是突变小鼠长骨短小、体形减小的组织学基础。

FGF信号可通过与细胞表面的FGFR2结合而对成骨细胞和软骨细胞的发育进行调控。Col Ⅱ主要由增殖软骨细胞表达，而Col Ⅹ主要由肥大软骨细胞表达，可作为软骨增殖、分化的标志基因。本研究结果显示，在出生早期，Fgfr2+/S252W小鼠Col Ⅱ、Col Ⅹ蛋白表达水平均较野生型下降，说明FGFR2功能持续增强导致小鼠软骨增殖、分化功能减弱，使长骨软骨内骨化过程受到抑制，这与传统研究认为FGF是一种促细胞分裂剂，与受体结合后可增加细胞的增殖能力[17-18]有所矛盾，需进一步论证。

综上，本研究证实FGFR2功能持续增强导致小鼠长骨发育障碍，FGFR2可能不仅具有调控成骨细胞系发育的功能，还具有调控软骨细胞系发育的作用，从而可能影响膜内成骨和软骨内成骨这两个过程，在骨骼发育等方面发挥重要作用。虽然本研究证实FGFR2信号在骨骼发育过程中对软骨细胞增殖和分化具有负性调节作用，但由于FGFR2主要调控成骨细胞的发育，长骨的短缩除了软骨细胞发育障碍的因素外，是否同时有成骨细胞发育异常的参与有待进一步研究，且在骨发育过程中与软骨发育相关的FGFR1、FGFR3表达是否存在代偿性的变化值得更进一步探讨。

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Influence of gain-of-function mutation (Ser252Trp) in fibroblast growth factor receptor 2 gene on long bone development

CHEN Peng1,2, ZHANG Bo1, ZHANG Li1, ZHANG Lian-yang*
1Institute of Field Surgery, State Key Laboratory of Trauma, Burn and Combined Injury, Daping Hospital, Third Military MedicalUniversity, Chongqing 400042, China
2Department of Genera Surgery, 324 Hospital of PLA, Chongqing 400020, China
*

, E-mail: hpzhangly@163.com
This work was supported by the National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (2011CB964701)

ObjectiveTo observe the early postnatal long bone development in Fgfr2+/S252Wmutant m ice and littermate wild-type (WT) mice, and explore the effect of continued function enhancement of fibroblast grow th factor receptor 2 (FGFR2) gene on endochondral ossification.MethodsA mouse model of Fgfr2+/S252Wsimulated human Apert syndrome was reproduced by knock-in technique, and then the gain-of-function mutation Fgfr2+/S252Wm ice and littermate WT m ice were obtained after breeding and identification. Three Fgfr2+/S252Wand same number of WT mice were sacrificed at 7, 10, 14 and 28 postnatal days respectively, and the morphology of long bone was examined with X-ray and Micro CT, the structure of bone and cartilage was observed by HE staining, and the expression of gene in grow th plate was observed by immunohistochem ical analysis.ResultsFgfr2+/S252Wmouse model exhibited typical craniosynostosis and brachycephalium of Apert syndrome, accompanied by short stature, grow th retardation of long bone, delayed appearance of secondary ossification center, decrease of bone density and trabecula number. HE staining showed noticeable shortened zones of proliferation and hypertrophic chondrocytes, irregularity of cell arrangement, and small hypertrophic chondrocytes in the grow th plates of the mutant m ice. Immunohistochem ical analysis revealed that the expression of genes related to chondrocytes proliferation and differentiation was decreased in mutant mice.ConclusionsGain-of-function mutation in FGFR2 may lead to abnormal development of long bone in m ice. FGFR2 may have the function of regulating the development both of osteoblast and chondrocyte lineages, and play an important role in the process of skeletal development.

receptor, fibroblast grow th factor, type 2; acrocephalosyndactylia; chondrogenesis; osteogenesis

R682.19

A

0577-7402(2013)07-0540-05

2012-12-22；

2013-05-20)

(责任编辑：胡全兵)

国家重点基础研究发展计划(973计划)(2011CB964701)

陈鹏，硕士研究生。主要从事软骨内成骨方面的研究

400042 重庆 第三军医大学大坪医院野战外科研究所，创伤、烧伤及复合伤国家重点实验室[陈鹏(现在解放军324医院普通外科)、张波、张莉、张连阳]

张连阳，E-mail：hpzhangly@163.com