衍生化-气相色谱质谱法测定牛奶及奶制品中的三聚氰胺的研究

孙海燕，郭伟

（黑龙江八一农垦大学，大庆 163319）

三聚氰胺（Melamine）（化学式：C3H6N6）俗称密胺、蛋白精，学名三氨三嗪，分子量126.12，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料。它是白色晶体，无味，微溶于水，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、乙二醇、甘油、吡啶等。虽然三聚氰胺不可用于食品加工或食品添加物，但近年来，三聚氰胺被非法用于牛奶、婴儿配方奶粉、优酸乳、饼干、奶糖以及宠物食品中[1]，通常使用定氮仪检测原料乳及制品中蛋白质的含量时，一些不法者非法添加三聚氰胺而提高蛋白质含量。2008年9月，我国有5 000 多婴幼儿由于食用了被三聚氰胺污染的牛奶和奶粉而导致肾结石甚至死亡。2011年，市场上又出现了三聚氰胺污染的奶粉。因此，国家为了引导市场奶制品的发展，监测牛奶以及奶制品中三聚氰胺的含量是非常必要和重要的。由于蛋白质而导致悬浮物的存在，因此牛奶是复杂的样品基质，目前已经有许多检测方法应用于三聚氰胺的定量检测，主要包括液相色谱法[2-5]，薄层色谱法[6]，毛细管电泳[7-9]。对于婴幼儿奶粉，目前应用广泛的为液相色谱法，而这种方法不但检出限高，而且不能很好地判断三聚氰胺的假阳性结果，因此检测结果不可靠，并且对于样品中三聚氰胺含量低于检出限而高于规定标准的也无法检出。

采用气相色谱质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）测定了婴幼儿牛奶以及奶制品中三聚氰胺的残留量，取得了满意的效果。与上述其他方法相比较，该方法具有灵敏度高、检出限低，因此被广泛的应用到原料乳及乳制品中三聚氰胺的检测。

1 材料和方法

1.1 试剂和材料

试剂：甲醇（色谱纯，Fisher）；吡啶（色谱纯，Sigma）；衍生化试剂：99%BSTFA+1%TMCS（色谱纯，Sigma）；氨水（分析纯，天津科密欧）；乙酸铅（分析纯，天津科密欧）；三氯乙酸，（分析纯，天津科密欧）；三聚氰胺标准品（＞99.9%，中国计量科学研究院）；氨化甲醇（5 mL 氨水+95 mL 甲醇）。

材料：固相萃取小柱（Oasis MCX，60 mg·3 mL-1）；氦气（99.999%）；50 mL 比色管，50 mL 离心管，所有试验样品均购于大庆市当地超市，储存于4 ℃冰箱。

1.2 仪器设备

离心机（ZH 36 K，德国HERMLE）；超声波清洗机（SK8200H，上海科导超声仪器有限公司）；分析天平（梅特勒，感量0.000 1 g）；固相萃取装置（ASE-12，天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；氮气吹干仪（MTN-2800D，天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；旋涡混合器（XW-80A，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；超纯水处理器（CAHT-30L，北京湘顺源科技有限公司）；电子恒温箱（DGG-9240A，上海森信实验仪器有限公司）。

1.3 GC-MS 条件

GCMS-QP2010 plus 气相色谱-质谱仪（日本岛津公司）：配有电子轰击离子源（EI）。GC-MS 条件：色谱柱：Rxi-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升温：100 ℃保持1 min，以10 ℃·min-1的速率升温至220 ℃，保持1 min，以15 ℃·min-1升高至280 ℃，保持4 min；传输线温度：280 ℃；进样口温度：250 ℃；进样方式：不分流进样；进样量：1 μL。电离方式：电子轰击电离（EI）；电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；扫描模式：选择离子扫描（SIM），定性离子m/z 99、171、342，定量离子m/z 327。

1.4 标准溶液的制备

准确称取100 mg（精确到0.100 g）三聚氰胺标准品于100 mL 容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为1 mg·mL-1的标准储备液；准确吸取1 mg·mL-1三聚氰胺标准储备液1 mL于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，标准溶液浓度为10 g·mL-1，于4 ℃冰箱内储存，有效期3 个月。

1.5 样品前处理

1.5.1 牛奶及乳制品的提取

称取5 g 样品（精确至0.001 g）样品于50 mL 具塞比色管，加入1%三氯乙酸溶液40 mL，涡漩振荡30 s，40 ℃下超声提取15 min，加入2.5%乙酸铅溶液2 mL，用1%三氯乙酸溶液定容至刻度。充分混匀后，吸取溶液约30 mL 至50 mL 离心试管，以5 000 rpm·min-1离心10 min。上清液待净化。

1.5.2 净化

准确移取5 mL 待净化液至活化的固相萃取柱中，用3 mL 水、3 mL 甲醇淋洗，抽干后用3 mL 5%氨化甲醇溶液以1 mL·min-1的流速洗脱，收集洗脱液，50 ℃下氮气吹干。

1.5.3 衍生化

取上述氮气吹干后的残留物质，加入600 μL 的吡啶和200 μL 衍生化试剂（99%BSTFA+1%TMCS），混匀，在70 ℃下衍生反应30 min 后，GC-MS 法定量检测。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的建立

分别吸取1 mL 浓度为0、0.04、0.08、0.16、0.4、0.8、1.6 μg·mL-1的三聚氰胺标准溶液，按照1.5.3 条件进行衍生化，然后用GC-MS 测定，线性方程为y=2×106x-98 065，x 表示三聚氰胺溶液浓度（g·mL-1），y代表色谱峰面积，标准曲线图见图1。在信噪比（S/N=3）为3 时，三聚氰胺的最低检出限为0.02 μg·mg-1，国标中液相色谱的最低检出限为2 μg·mg-1。

图1 三聚氰胺标准溶液曲线图Fig.1 Standard curve of melamine

2.2 实际样品的测定

试验分别选择了市售的牛奶、奶粉及酸奶来验证方法的可行性，采用1.5 进行样品前处理，考察了添加浓度水平分别在0.2、0.5、1 μg·mL-1的三聚氰胺在牛奶、奶粉及酸奶中的回收率和相对标准差，结果见表1，空白样品及加标样品的色谱图见图2、图3、图4、图5。

表1 样品中三聚氰胺的回收率和相对标准差Table 1 Recovery and RSD of mMelamine in sample

图2 空白样品色谱图Fig.2 Blank sample chromatogram

图3 添加0.2 μg·mL-1 三聚氰胺的牛奶色谱图Fig.3 Milk chromatogram of 0.2 μg·mL-1 melamine

图4 添加0.5 μg·mL-1 三聚氰胺的奶粉色谱图Fig.4 Milk powder chromatogram of 0.5 μg·mL-1 melamine

图5 添加1 μg·mL-1 三聚氰胺的酸奶色谱图Fig.5 Yoghurt chromatogram of 1 μg·mL-1 melamine

3 结论

研究了衍生化-气相色谱质谱法检测牛奶以及奶制品中三聚氰胺残留量，三聚氰胺浓度范围在0.04～1.6 μg·mL-1之间，具有良好的线性关系，相关系数r=0.999 1。利用衍生化的方法分别测定了牛奶以及奶制品中9 个样品的三聚氰胺含量，并测定了样品中添加浓度为0.2、0.5、1 μg·mL-1的回收试验，回收率在93.8%～106.4%，连续进样5 次，RSD 在3.8%～4.9%之间。结果表明：具有灵敏度高、检出限低、回收率高的特点，适合含量较低的婴幼儿牛奶及奶制品中三聚氰胺的定性及定量检测。

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