高效液相色谱法测定当药中龙胆苦苷含量

段吉平，冯 丽，张立涛

（河北省食品药品检验院，河北 石家庄 050011）

当药，又名紫花当药，为河北、内蒙古一带的民间草药，中医临床用量较少，中药生产企业主要用于当药片和当飞利肝宁胶囊的生产。其在历代本草中未见收载，在《内蒙古中草药》[1]中有收载，生于海拔500～1 600 m的山坡、林下或灌丛中，为龙胆科植物瘤毛獐牙菜 Swertia pseudochinensis Hara的干燥全草，具有清湿热、健胃功能，用于湿热黄疸、胁痛、痢疾腹痛、食欲不振，其有效成分为龙胆苦苷[2]。现采用高效液相色谱法，对龙胆苦苷的含量测定方法进行了研究，为更好地控制当药的质量提供了可靠的方法。

1 仪器与试药

Mettler AE 163型 Mettler AE 240型电子天平（瑞士）；Shimadzu UV-2450型紫外-可见分光光度计（日本）；Waters 2695-2996型高效液相色谱仪（美国）。龙胆苦苷对照品（供含量测定用，批号为110770-200510，中国药品生物制品检定所）；试剂为甲醇（色谱纯）；水为去离子水；当药（收集于安国药市，由河北省药品检验所主任药师牛小莲鉴定，编号与产地，1号、2号、3号均为河北，4号、5号、6号均为内蒙。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Capcell pak C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 - 水（20 ∶80）；流速：1.0 mL／min；检测波长：274 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。高效液相色谱图见图 1。

2.2 溶液制备

取龙胆苦苷对照品0.010 12 g，置25 mL容量瓶中，加甲醇适量使溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品浓溶液。精密量取对照品浓溶液5.00 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。取当药药材粉碎过3号筛，混匀，称取粉末2 g，精密称定，置 100 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率 250 W，频率 40 kHz）20 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：精密量取龙胆苦苷对照品浓溶液（质量浓度为 0.404 8 mg／mL）5 mL，置 100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得龙胆苦苷对照品稀溶液。取对照品稀溶液2，10 μL和龙胆苦苷对照品浓溶液5，10，15 μL，分别注入液相色谱仪，按拟订的色谱条件测定，以峰面积积分值(Y)为纵坐标、龙胆苦苷对照品进样量(X)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y=1 264 734 X+20 446.7， r=0.999 9(n=5)，结果表明，龙胆苦苷进样量在0.040 48～6.072 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

精密度试验：精密吸取对照品溶液5 μL，连续进样5次，测定龙胆苦苷峰面积。结果的 RSD为0.78%（n=5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取龙胆苦苷对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪11次，前 6次间隔 1.5 h，后 5次间隔 3 h；取供试品溶液 10 μL，注入液相色谱仪9次，前5次间隔1.5 h，后4次间隔5 h，记录龙胆苦苷峰面积积分值。结果对照品溶液的 RSD为0.92%，供试品溶液的 RSD为0.84%，表明对照品及供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取同一批样品（1 号）粉末 1.6，2.0，2.4 g 各 3份，精密称定，按2.2项下的方法制成供试品溶液，按拟订方法测定，样品的平均含量为 1.549 mg／g，RSD 为 1.1% （n=9），表明方法重复性良好。

加样回收试验[3]：精密称取已知含量的样品（1号，含量为1.549 mg／g）适量，共 6份，分别加入高、中、低质量浓度的龙胆苦苷对照品溶液，按供试品溶液的制备与测定方法测定龙胆苦苷含量，并计算回收率。结果见表1。

表1 龙胆苦苷加样回收试验结果（n＝6）

2.4 样品含量测定

取5批当药，按前述2.2项下方法操作，制成供试品溶液，按上述检测方法测定，计算样品含量。结果批号分别为071203，060401，080103，080102，071204，080101 的样品中龙胆苦苷含量分别为 0.15% ，0.27% ，0.19% ，0.18% ，0.16% ，0.17% 。

3 讨论

本试验还采用3个厂家的色谱柱，色谱柱型号分别为：岛津Shimadzu Vpodssygg（150 L ×6.0 mm），戴安Dionex Acclaim 120 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、菲罗门Phenomenex C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），考察对分离及测定的影响，结果 3 种C18色谱柱柱效、分离度均符合要求，并且含量无明显区别，故认为本法对C18色谱柱品牌无特定要求。

龙胆苦苷具有镇痛、抗炎的作用[2]，为当药的有效成分，用高效液相色谱法测定当药中龙胆苦苷尚未见报道。本研究建立的HPLC检测方法精密度、重现性好，杂质干扰少，龙胆苦苷的峰纯度、峰形、分离度均比较理想，样品稳定性和回收率均较高，是一种理想的测定方法。

[1]内蒙古自治区革命委员会卫生局.内蒙古中草药[M].呼和浩特：内蒙古自治区人民出版社，1972：206－207.

[2]陈 雷，王海波，孙晓丽，等.龙胆苦苷镇痛抗炎药理作用研究[J].天然产物研究与开发，2008（5）：903 － 906.

[3]徐艳红，陆 君，郭汉文，等.高效液相色谱法测定结肠消炎丸中芦丁含量[J].中国药业，2011，20（19）：34 － 35.