马铃薯腐烂茎线虫脂肪酸去饱和酶新基因(Dd-FAD)的克隆与序列分析

邵 颖， 万景旺， 冯 辉， 朱 华， 程兆榜， 周益军， 魏利辉

(江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏 南京 210014)

马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor Thorne)是垫刃目中一类重要的植物病原线虫，在中国主要为害甘薯和马铃薯，此外还危害中药材当归、薄荷和人参等［1-2］。目前，马铃薯腐烂茎线虫病在中国北京、天津、山东、河北、河南、江苏、浙江、福建、辽宁、甘肃等省市均有发生，已经成为危害中国甘薯生产的重要病害。

脂肪酸去饱和酶存在于几乎所有生物中，是催化多不饱和脂肪酸生物合成的关键酶类。尤其N-3系列和n-6系列多不饱和脂肪酸是细胞生物膜的重要组成成分，对生物膜的生化活性及维系细胞的生物学功能起着重要的调节作用［3］。

目前秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)共克隆得到7条脂肪酸去饱和酶基因，即FAT-1至FAT-7。FAT-5、FAT-6、FAT-7都编码Δ-9脂肪酸去饱和酶，其中FAT-5编码Δ-9脂肪酸去饱和酶可以催化软脂酸变成棕榈油酸，FAT-6和FAT-7所编码Δ-9脂肪酸去饱和酶可以催化硬脂酸形成油酸。国内外未见马铃薯腐烂茎线虫脂肪酸去饱和酶的报道，本研究试图克隆危害甘薯的马铃薯腐烂茎线虫脂肪酸去饱和酶基因，为今后对其基因功能分析提供科学依据，及为该病害的防控提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 线虫材料与试剂

马铃薯腐烂茎线虫为江苏省农业科学院植物保护研究所线虫实验室收集、培养和保存的种群。培养和分离方法为:将线虫消毒后接种于甘薯，培养1～2月出现病症后将病薯切成小块，采用浅盘法分离线虫;浸泡48 h后移去筛盘，将底盘中的线虫悬浮液通过500目(孔径26 μm)筛收集线虫。

TRIzol RNA提取试剂盒购于Invitrogen公司;5'及3'端SMARTer RACE试剂盒购自Clontech公司;反转录酶、RNA酶抑制剂购自Fermentas公司;pMD18-T载体、Ex Taq DNA聚合酶均购自TaKaRa公司;DH5α感受态细胞购自全式金公司。

1.2 马铃薯腐烂茎线虫总RNA提取及cDNA第一链合成

参照TRIzol(Invitrogen)使用说明，提取样品总 RNA。cDNA合成参照M-MuLV反转录酶使用说明。

1.3 马铃薯腐烂茎线虫cDNA片段的同源克隆

以FA上游引物和下游引物为简并引物(表1)，以cDNA第一链为模板进行PCR扩增，PCR体系为:10×Buffer(含 Mg2+25 mmol/L)2.5 μl，dNTP(10 mmol/L)0.5 μl，引物(10 μmol/L)各 1.0 μl，模板 DNA 1.0 μl，Taq 酶 0.5 μl，加水补足25.0 μl。PCR反应程序为:94℃变性4 min;94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min进行35个循环;最后72℃延伸10 min，扩增产物于4℃保存。PCR产物于1.0% 琼脂糖在电压120 V条件下电泳20 min，用EB染色，在凝胶成像系统拍照保存。

表1 所用PCR引物Table 1 PCR primers used in this study

1.4 3'端第一链cDNA的合成

用Clontech公司的SMARTer RACE cDNA合成试剂盒合成 3'端第一链 cDNA，采用 10.00 μl体系:3.75 μl总RNA，1.00 μl 3'RACE CDS Primer A 混匀，72 ℃ 3 min，42℃ 2 min 温育，然后加入 2.00 μl Buffer，1.00 μl DTT，1.00 μl dNTP，1.00 μl反转录酶，0.25 μl RNase 抑制剂，混匀后在42℃ 90 min，70℃ 10 min，加入150.00 μl EDTA稀释。

1.5 3'RACE

以合成的3'端第一链cDNA为模板，以GSP-3上游引物1和RACE外侧引物进行PCR扩增，反应条件为:94℃预变性3 min;94℃变性30 s，72℃延伸3 min，5个循环;94℃变性30 s，68℃延伸30 s，72℃延伸2 min，5个循环;94℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸2 min，25个循环;72℃延伸10 min。反应采用 25.00 μl体系:2.50 μl 10 × PCR buffer，2.50 μl MgCl2，2.00 μl dNTP(2.5 mmol/L)，引物 GSP-3上游引物 1 和 RACE 外侧引物(10 μmol/L)各 1.00 μl，0.25 μl Ex Taq DNA 聚合酶(5 U/μl)，1.00 μl第1 链cDNA，PCR级水补齐25.00 μl。再以PCR产物为模板，以GSP-3F2和RACE内侧引物进行巢式PCR，反应条件为:94℃变性3 min;94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，纯化目的片段，再进行连接、转化、克隆、PCR菌液检测后测序。

1.6 5'端第一链cDNA的合成

采用Clontech公司的SMARTer RACE cDNA合成试剂盒合成5'端第一链 cDNA，采用 10.00 μl体系:2.75 μl总RNA，1.00 μl 3'RACE CDS Primer A 混匀，72 ℃ 3 min，42℃ 2 min 温育，然后加入 2.00 μl Buffer，1.00 μl DTT，1.00 μl dNTP，1.00 μl反转录酶，0.25 μl RNase 抑制剂，1.00 μl oligoⅡA，混匀后在42℃ 90 min，70℃ 10 min，加入100.00 μl EDTA稀释。

1.7 5'RACE

以合成的5'端第一链cDNA为模板，以GSP-5下游引物1和RACE外侧引物为引物，以GSP-5下游引物2和RACE内侧引物为引物，进行巢式PCR。反应条件与3'RACE相同。PCR产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，纯化目的片段，再进行连接、转化、克隆、PCR菌液检测后测序。

1.8 脂肪酸去饱和酶cDNA全长扩增

将cDNA序列拼接后，利用软件Primer 5.0设计全长特异引物FAD上游引物和FAD下游引物进行全长扩增。PCR体系为:10 × Buffer(含 Mg2+25 mmol/L)2.5 μl，dNTP(10 mmol/L)0.4 μl，引物(10 μmol/L)各 1.0 μl，模板 DNA 1.0 μl，Taq 酶 0.5 μl，加水补足 25.0 μl。PCR 反应条件:94 ℃变性4 min;94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 2 min进行35个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，纯化目的片段，再进行连接、转化、克隆、PCR菌液检测后测序。

1.9 脂肪酸去饱和酶cDNA序列分析

在 NCBI网站 (www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行基因Blastx同源比对分析，用软件DNAMAN对基因cDNA序列进行开放性阅读框预测及其核苷酸序列翻译，以软件phylip临近距离法构建系统树。以Compute pI/Mw(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)进行蛋白质分子量 (Mw)预测。使用在线工具(http://www.cbs.dtu.dk/ser vices/NetNGlyc/)对蛋白质序列中可能存在的N糖基化位点进行预测。

2 结果

2.1 马铃薯腐烂茎线虫Dd-FAD cDNA全长克隆及序列分析

使用简并引物FA上游引物和FA下游引物进行PCR扩增，电泳检测到300 bp的cDNA条带，对其进行回收。经BLAST分析发现此片段与其他植物寄生线虫部分序列高度同源，表明此cDNA片段为目的基因脂肪酸去饱和酶片段。用特异引物对目的基因3'和5'进行RACE扩增和测序，分别获得660 bp片段和525 bp片段，利用DNASTAR软件将扩增和测序后的cDNA片段进行拼接，获得一个全长为1 002 bp的cDNA序列。根据序列拼接结果，设计特异引物进行验证，进一步确认cDNA全长序列。该基因cDNA全长序列为1 183 bp，5'端起始密码子ATG前有一段109 bp的非编码区，3'端有一段72 bp的非编码区，且3'端有多聚腺苷酸尾及加尾信号序列(AATAAA)，说明克隆出来的是完整的cDNA序列，命名为Dd-FAD，GenBank登录号为KF001837。

2.2 马铃薯腐烂茎线虫Dd-FAD氨基酸序列分析

氨基酸序列分析结果显示，马铃薯腐烂茎线虫Dd-FAD基因由334个氨基酸组成。将Dd-FAD序列与线虫纲已报道的脂肪酸去饱和酶蛋白质进行多序列比对分析，并利用phylip软件临近距离法(Neighbor joining)构建系统进化树。根据在线工具预测，该氨基酸序列存在2个潜在的N-糖基化位点，它们分别是位于第252～255位的NISP和第291～294位的NFTK。该蛋白质的分子质量(Mw)为38 700，等电点(pI)为8.78。

BLAST比对发现，Dd-FAD与Cr-FAD-5的序列相似性为72.00%，与Cb-FAD-6和Cab-FAD的序列相似性为59.00%。表明马铃薯腐烂茎线虫的Dd-FAD为脂肪酸去饱和酶。系统发育分析发现，Dd-FAD与Cab-FAD、Cb-FAD和Cr-FAD聚为一支，说明它们亲缘关系比较近。

3 讨论

最近的研究发现，脂肪酸去饱和酶在秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)抗寒过程中作用非常关键，尤其硬脂酰-CoA去饱和酶，该酶在与辅酶A相结合的饱和脂肪酸的Δ-9引入双键形成单不饱和脂肪酸，在生物体内的脂类代谢以及能量消耗过程中起着关键作用。Murray等研究发现，将秀丽小杆线虫移到低温时，脂肪酸去饱和酶FAD-7的转率表达丰度迅速上升［4］;Brock等发现把秀丽小杆线虫FAD-6和FAD-7基因同时沉默，突变体在－10℃低温处理后，存活率低于1.00%［5］。Ladygina最早发现马铃薯腐烂茎线虫在－28℃下可以存活。最新的研究发现该线虫在－20℃条件下处理180 d存活率为49.01%，在－70℃条件下处理180 d后存活率仍达到19.21%［6］。目前脂肪酸去饱和酶基因在植物寄生线虫中还未见报道，对其确切的生物学功能研究还不清楚。

本试验首次成功克隆出马铃薯腐烂茎线虫脂肪酸去饱和酶Dd-FAD基因，该基因编码334个氨基酸，与Cr-FAD的序列相似性为72.00%，与Cb-FAD和Cab-FAD的序列相似性为59.00%，由此确定我们克隆的基因为FAD基因。该氨基酸序列存在2个潜在的N-糖基化位点，它们分别是位于第252～255位的NISP和第 291～294位的NFTK。该蛋白质分子质量(Mw)为38 700，等电点(pI)为8.78。

在cDNA全长克隆的基础上，对马铃薯腐烂茎线虫脂肪酸去饱和酶蛋白质进行功能分析，可以促进人们对马铃薯腐烂茎线虫致病基因功能的了解。本试验分析了Dd-FAD序列并预测了其编码蛋白质的结构和功能，今后将对该基因蛋白质功能进行分析并进行RNA干扰。

［1］杨宝君，李静华.当归麻口病病因初步探讨［J］.植物病理学报，1990，20(1):20.

［2］中国农作物病虫害编辑委员会编.中国农作物病虫害［M］.北京:农业出版社，1979:460-465.

［3］KANG J X.From fat to fat-1:A tale of omega-3 fatty acids［J］.Membrane Biology，2005，206(2):165-72.

［4］MURRAY P，HAYWARD S，GOVAN G G，et al.An explicit test of the phospholipid saturation hypothesis of acquired cold tolerance in Caenorhabditis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104:5489-5494.

［5］BROCK T J K，BROWSE J ANDWATTS J L.Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C.elegans［J］.PLoS Genetics，2006，2:108.

［6］LADYGINA N M.Effects of temperature and humidity on the stem nematode of potato and onion［J］.Trudy NI Inst Biol priBiol Fak Khar Kovskogo Gos Univ，1957，27:101-114.