老年男性心功能不全患者外周血CD4+和CD8+调节T细胞的变化及免疫调节的干预作用

韩丽娜，林晓明，臧传波，李靖，杨立明，丁国雷，彭锦

（1.中国人民解放军总医院海南分院保健科，海南三亚572014；2.中国人民解放军第187中心医院心内科，海南海口571159）

老年男性心功能不全患者外周血CD4+和CD8+调节T细胞的变化及免疫调节的干预作用

韩丽娜1，林晓明2，臧传波1，李靖1，杨立明1，丁国雷1，彭锦2

（1.中国人民解放军总医院海南分院保健科，海南三亚572014；2.中国人民解放军第187中心医院心内科，海南海口571159）

目的探讨T淋巴细胞亚群CD4+调节细胞（CD4+CD25+Treg）和CD8+调节细胞（CD8+CD28-Treg）在老年男性慢性心功能不全患者外周血中的变化，以及免疫调节治疗对其的影响。方法155例老年男性，114例诊断为慢性心功能不全（CCI），41例为心功能正常者。所有患者均行超声心动图检测，并采集外周血。分离外周血T淋巴细胞，采用流式细胞学检测技术测定CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg亚群分布。非均相免疫法检测血浆N末端脑利钠肽前体（NT-proBNP）水平，免疫比浊法检测C反应蛋白（CRP）。参与者分成三组，第一组是正常对照组(n=41)，第二组是CCI干预组(n=60)，接受常规抗心功能不全和胸腺五肽治疗(20 mg，肌肉注射，隔日1次，共3个月)，第三组是CCI对照组（n=54），只给予常规抗心功能不全治疗。结果与对照组相比，CCI两组左室射血分数（LVEF）、CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg亚群水平下降；而左室舒张末期内径（LVEDD）、NT-proBNP和CRP水平升高。NT-proBNP和CRP水平同LVEF呈负相关，CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg水平同LVEF呈正相关。而CCI干预组较CCI对照组能更好地升高CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-reg亚群水平而改善心功能。结论CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg水平变化提示其在CCI过程中发挥重要作用，CD4+和CD8+调节T细胞变化可能是治疗CCI的重要方向之一。

慢性心功能不全；免疫；老年；CD4+CD25+Treg；CD8+CD28-Treg

世界老年人口迅速增多，慢性心功能不全在老年人群多发，已经成为老年人死亡的主要原因之一。慢性心功能不全(Chronic cardiac insufficiency，CCI)作为一种综合征，具有慢性炎症及免疫性疾病的某些特征[1]，自身免疫参与CCI病情发展[2-3]，现公认CD4+T细胞的活化在心力衰竭心脏局部的炎症发展和全身的免疫反应中起关键性作用[4]。调节性T细胞(Regulatory T cells，Tregs)是在免疫应答的负调节及自身免疫耐受中发挥重要作用，Tregs的激活可以抑制CD4+T细胞的介导炎症反应和免疫杀伤的功能。有报道在CCI中存在Th17/Tregs比例升高[5]，但CD8+CD28-Tregs在CCI中的意义却未见报道。本研究收集CCI病例，并给予抗心功能不全和免疫调节治疗，观察CD4+CD25+Tregs和CD8+CD28-Tregs调节细胞在CCI中的变化以及免疫调节治疗的影响，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2008年1月至2012年12月来自解放军总医院老年心内科和中国人民解放军第187医院的155例患者，其中CCI患者114例和心功能正常者41例。CCI患者根据病史、体格检查、胸部X-线片、心电图和N-末端前脑利钠肽(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)诊断。入选CCI患者在6个月前有收缩期和舒张期功能异常，美国纽约心脏分级(New York HeartAssociation，NYHA)心功能分级法为Ⅰ～Ⅳ级。所有患者使用药物治疗至少30 d，包括血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素受体抑制剂(ARBs)、β受体阻滞剂。排除标准包括急性、慢性炎症，或其他自身免疫性疾病、3个月内发生不稳定心绞痛和急性心肌梗死、3个月内风湿性疾病活动病灶、糖尿病、甲状腺机能亢进或其他内分泌疾病(近期使用过免疫调节剂)、严重肝、肾功能不全和肿瘤。最后，155例老年男性患者入选，年龄57～95岁，平均81.3岁，114例CCI患者，年龄59～95岁，平均81.6岁，41例心功能正常，年龄56～94岁，平均79.5岁。原发性疾病是冠心病96例，心律失常87例，高血压58例，慢性风湿性心脏病2例，扩张型心肌病5例，老年性退行性瓣膜病8例，其中99例合并多种疾病。

1.2 分组根据NYHA心功能分级方法患者分3组，所有患者心功能级别由同一名医师确定。将155例患者分成三组，第一组是正常对照组，心功能正常，41例；第二组是CCI干预组(心功能Ⅰ/Ⅱ级，体力活动轻、中度受限)，60例，给予慢性心功能不全常规治疗基础上给予胸腺五肽(Thymopentin，TP5) (20 mg，肌肉注射，隔日一次，共3个月)治疗；第三组是CCI对照组(心功能Ⅲ/Ⅳ级，体力活动高度受限)，54例，只给予慢性心功能不全常规治疗。在治疗前、后进行超声心动图、BNP、CRP和CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg检测。

1.3 超声心动图检测所有患者均在我院超声科使用美国GE公司VV7彩色多普勒超声仪进行超声心动图检测，关于心功能测量数据有室间隔厚度、左室后壁厚度、左室收缩末期容积、左室舒张末期容积、左室收缩末期内径，左室舒张末期内径(Left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)和左室射血分数(Left ventricular ejection fraction，LVEF)。在本研究中，我们选择LVEDD和LVEF作为衡量心功能的客观指标。

1.4 标本采集和BNP测量患者在治疗前、后及安静情况下抽取2 ml静脉血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝试管保存，分离血浆，使用全自动生化仪非均相免疫法检测BNP水平，免疫比浊法检测CRP。PC5-标记抗-CD4+单克隆抗体、PE-标记抗-CD25单克隆抗体、FITC-标记抗-CD8单克隆抗体、PE-标记抗-CD28单克隆抗体和OptiLyse®C溶解液购自美国Beckman-Coulter公司。

1.5 流式细胞术分析患者在治疗前、后及安静状态下取肘静脉1 ml外周血，收集到EDTA抗凝试管中。分析外周血CD4+CD25+分布，100 μl抗凝外周血加入藻红蛋白-菁蓝色素荧光素(PE-Cy5，PC5)标记抗-CD4单克隆抗体、藻红蛋白(PE)-标记抗-CD25单克隆抗体避光共同避光孵育20 min。为分析外周血CD8+和CD28-分布，100 μl抗凝外周血加入FITC-标记抗CD8单克隆抗体，PE-标记抗-CD28单克隆抗体共同避光孵育20 min。每种抗体的量是5 μl，在上机检测之前使用OptiLyse®C溶解液溶解红细胞，流式细胞仪为美国Beckman-Coulter公司FACScan流式细胞仪。每次至少10 000个淋巴细胞被标记的单克隆抗体染色。阳性细胞采用CXP软件包计算，用百分比表示。

2 结果

2.1 临床结果CCI两组病例中，年龄、心功能级别、原发病构成比均衡，心功能明显差于正常对照组。与正常对照组比较，CCI两组LVEF和6MWT水平降低，LVEDD、NT-proBNP和CRP水平升高(P＜0.01)，CCI两组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05)。患者基线情况见表1。

2.2 CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg在不同心功能组的分布与正常对照组比较，CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg在CCI两组降低(P＜0.01)，CCI两组之间差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2和图1、图2。

表1 患者基本情况

表1 患者基本情况

注：LVEF(左室射血分数)；LVEDD(左室舒张末期内径)；6MWT(6 min步行试验)；NT-proBNP(N-末端前脑利钠肽)；CRP(C反应蛋白)。与正常对照组比较，aP＜0.01。t值(1)：CCI干预组vs正常对照组；t值(2)：CCI对照组vs正常对照组；t值(3)：CCI干预组vs CCI对照组。

项目年龄(岁) NYHA(Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ，例)冠心病(例)心律失常(例)高血压(例) LVEF(%) LVEDD(mm) 6MWT(m) NT-proBNP(pg/ml) CRP(mg/dl) CCI干预组(n=60) 82±9 21/22/17 44 45 29 39.1±3.4a58±5a287±13a863±102a5.34±0.57aCCI对照组(n=54) 81±10 19/19/16 39 40 23 38.3±3.3a59±4a286±14a878±109a5.52±0.63a正常对照组(n=41) 79±10 0/0/0 13 t值(1)t值(2)t值(3) 26 60.9±4.2 46±3 413±15 56±11 0.27±0.08 28.75 13.76 44.95 50.42 56.77 33.89 17.39 42.42 47.99 50.20 1.29 1.57 0.40 1.01 1.63

表2 治疗前CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg在不同老年CCI患者中的分布(%)

表2 治疗前CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg在不同老年CCI患者中的分布(%)

注：与正常对照组比较，aP＜0.01。t值(1)：CCI干预组vs正常对照组；t值(2)：CCI对照组vs正常对照组；t值(3)：CCI干预组vs CCI对照组。

60 54 41 CCI干预组CCI对照组正常对照组t值(1) t值(2) t值(3) 6.8±1.8a6.7±1.4a16.2±3.3 18.4 19.0 0.3 11.9±2.5a11.2±2.1a35.8±5.3 30.4 31.1 1.63

2.2 CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg在不同心功能组的分布与正常对照组比较，CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg在CCI两组降低(P＜0.01)，CCI两组之间差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2和图1、图2。

2.3 NT-proBNP、CRP、CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg与LVEF的相关性NT-proBNP、CRP和LVEF呈负相关(NT-proBNP：r=-0.71，CRP：r=-0.72，P＜0.01)，CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg水平和LVEF呈正相关(CD4+CD25+Treg：r=0.67，CD8+CD28-Treg：r= 0.73)，见图3。

2.4 免疫调节治疗对心功能的影响免疫调节治疗可以降低LVEDD、NT-proBNP、CRP，提高LVEF、6MWT水平。但CCI干预组LVEDD、NT-proBNP、CRP水平较CCI对照组水平更低，LVEF、6MWT水平较CCI对照组水平更高，见表3。

表3 免疫调节治疗对心功能的影响

2.5 免疫调节治疗对CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg分布的影响和正常对照组比较，CCI患者CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg水平降低。与CCI对照组比较，CCI干预组能更好升高CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg水平，见表4和图4、图5。

表4 免疫调节治疗对CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg分布影响(%)

图1 治疗前CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg在不同老年CCI患者中的分布

图2 治疗前CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg在不同老年CCI患者中的分布

图3 NT-proBNP、CRP、CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg与LVEF的相关性

图4 免疫调节治疗对CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg分布的影响

图5 免疫调节治疗对CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg分布的影响

3 讨论

心力衰竭是各种心脏病的严重阶段，免疫参与心力衰竭的病理生理过程。慢性心力衰竭是一种复杂的临床症状群，是各种心脏病的严重阶段，其发病率高且随年龄增长而显著增加，五年存活率与肿瘤相仿[6-7]。近期统计结果显示，我国成年人中约有400万心力衰竭患者。引起CHF原因依次是冠心病、高血压性心脏病、风心病、扩张型心肌病(DCM)及老年性退行性瓣膜病。冠心病、高血压、糖尿病等多种疾病同时存在对心功能的影响呈累加效应[8-9]。

临床观察及实验研究结果显示，心衰是由于初始心肌损伤(心肌梗死、血流动力学负荷过重、炎症)，引起心肌结构和功能的变化，导致心室泵血功能低下，引发针对心脏组织自身抗体的形成。另一方面，CHF在心肌损伤与重构的过程中，正常隐蔽的心肌组织成分可以被释放或暴露，受到自身免疫攻击，进一步引发有关自身抗体的生成[10]。因而，放射性核素I111标记抗心肌肌凝蛋白单克隆抗体单光子发射计算机断层扫描用于诊断和预后心肌炎、扩张性心肌病和心梗等心脏疾病[11]。研究表明，CHF患者血清中可存在多种心脏器官特异性的自身抗体，如抗心肌肌凝蛋白、心肌肌钙蛋白和G蛋白耦联受体等自身抗体上。

目前研究认为心肌炎症、心室重构和心力衰竭中CD4+亚群Th1/Th2比例、Th17/Treg比例发生变化[12,5]，其中Th1和Th17介导细胞免疫和免疫反应，加速病情发展；而Th2类细胞因子对CHF有保护性作用；外周血中Thl和Th2细胞因子水平变化对判断预后有较好的预测价值[13-14]。我们前期实验发现CHF常规治疗联合免疫调节治疗，通过降低Th1表面转录因子T细胞表达T-box(T-bet)mRNA表达，提高Th2转录因子GATA结合蛋白3(GATA-3)mRNA表达，较单纯心力衰竭常规治疗更能降低Th1/Th2，提高心脏射血分数[15]。

我科主要收治老年男性患者，为本研究提供了病例来源，我们根据心功能将患者分为三组。在客观检查确定CCI后，我们选择LVEF、LVEDD、NT-proBNP、CRP作为衡量CCI心功能指标，并分析它们和LVEF之间的关系。结果同目前普遍观点一致[16-19]。

CD4+CD25+能抑制性调节CD4+和CD8+T细胞的活化与增殖，达到免疫负调节作用。近年研究表明，缺乏CD28表达的CD8+CD28-细胞同CD4+CD25+Tregs一样，具有免疫抑制活性，也是Tregs中的一个重要群体。CD8+CD28-在自身免疫病、老年人、肿瘤患者、慢性病毒、异体移植体内中存在并发挥重要作用，既能抑制T细胞增殖又能抑制其毒性[20-25]。CD8+CD28-Treg是由CD8+T细胞受抗原慢性刺激分化而来的终末型细胞，在炎症组织和/或在淋巴结中非定型CD8+CD28-T细胞才是调节性细胞的来源。

抗心功能不全治疗可以通过升高CD4+CD25+和CD8+CD28-Tregs细胞数量而改善心功能，常规抗心功能不全治疗结合免疫调节治疗能更好的升高CD4+CD25+和CD8+CD28-Tregs而改善心功能。因此我们推测CD4+CD25+和CD8+CD28-Tregs导致CCI患者免疫抑制功能低下，对炎症反应和免疫激活抑制功能减低而促进了CCI疾病病程发展；免疫调节治疗可以通过升高CD4+CD25+和CD8+CD28-Tregs比例而改善心功能。

（志谢：衷心感谢肿瘤大楼细胞实验室吴亮亮协助行外周血流式细胞术检测T淋巴细胞亚群分布。）

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Analysis of change in percentage of CD4+and CD8+Treg in peripheral blood in aged male patients with chronic cardiac insufficiency.

HAN Li-na1,LIN Xiao-ming2,ZANG Chuan-bo2,LI Jing1,YANG Li-ming1,DING Guo-lei1, PENG Jin2.1.Department of Health Care,Hainan Branch Chinese PLA General Hospital,Sanya 572014,Hainan, CHINA;2.Department of Cardiology,the 187thCentral Hospital of Chinese PLA,Haikou 571159,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the change in percentage of CD4+CD25+Treg and CD8+CD28-Treg in peripheral blood in aged male patients with chronic cardiac insufficiency(CCI).MethodsThe participants were 155 elderly men,among whom 114 were diagnosed as CCI and 41 had normal heart function.All patients underwent echocardiography examination and had their peripheral blood collected.T lymphocytes in peripheral blood were separated and determined distribution of CD4+CD25+Treg and CD8+CD28-Treg using flow cytometry.Serum N terminal pro-brain natriuretic peptide(NT-proBNP)levels were detected by heterogeneous immunoassay.C reactive protein(CRP)was detected by immunoturbidimetry assay.Participants were divided into three groups:the CCI intervention group(

regular therapy and thymopendin,20 mg intramuscular injection,once every other day for 3 months,n=60),the CCI control group(received regular therapy,n=54),and the control group(n=41).ResultsIn comparison to the control group,levels of left ventricular ejection fraction(LVEF),CD4+CD25+Treg and CD8+CD28-Treg decreased in CCI intervention group and CCI control group,while levels of left ventricular end diastolic diameter(LVEDD),NT-proBNP and CRP increased.Levels of NT-proBNP and CRP were negatively correlated with LVEF,while levels of CD4+CD25+Treg and CD8+CD28-Treg showed positive correlation with LVEF.LVEF could be much improved via increasing distribution of CD4+CD25+Treg and CD8+CD28-Treg in CCI intervention group than in CCI control group.ConclusionThe abnormal distribution of CD4+CD25+Treg and CD8+CD28-Treg suggestes that they play an important role in the development of CCI.Modulation of these T lymphocytes subsets might be a strategy to treat CCI.

Chronic cardiac insufficiency;Immunity;Aged;CD4+CD25+Treg;CD8+CD28-Treg

R541

A

1003—6350（2013）19—2866—07

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.19.1196

2013-03-04)

中国人民解放军总医院临床科研扶持基金（编号：2012FC-TSYS-2024）；2012年度海南省医学普通科研立项课题（编号：琼卫2012PT-66）；海南省社会发展科技专项资金项目（编号：SF201337）

林晓明。E-mail：lxm_187@126.com；臧传波。E-mail：txzzce@sina.cn