臭氧参与NAD+/NADH氧化还原反应机理的理论研究

田文欣

(陕西广播电视大学，西安 710068)

1 NADH对生物分子的作用机理

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)及其还原形式(NADH)是一类重要的氧化还原辅酶。在生物体内，NAD+和NADH在酶的催化下通过夺氢或给氢能将特定的物质氧化或还原，为能量的存储和释放提供必要的准备，是细胞能量代谢所必需的辅酶。生物体内的许多氧化还原反应和代谢过程都离不开它们的参与，其中，NAD+和NADH参与的多酶氧化还原体系是生物体细胞呼吸链中电子传递过程的主要生物氧化体系，糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解时的氧化反应绝大部分也都是通过这一体系完成的，例如，糖酵解、三羧酸循环和线粒体呼吸链中的氧化还原反应。

NADH的主要功能是实现电子传递。具有还原性的化合物如葡萄糖被氧化后会释放能量，这些能量被转移到 NAD+上，发生还原反应成为NADH，该反应是糖酵解和三羧酸循环的一部分。在真核生物中，NADH与NAD+之间的转化是一个最重要的生物氧化还原反应。例如，在线粒体中的电子转移链中，NADH作为富能电子转移辅酶参与ATP的合成。监视NADH的氧化还原状态是表征活体内线粒体功能的最佳参数。NADH结构见图1。

图1 NADH结构

NADH的氧化和还原形式均被设置于反应的连接作用中，可运送电子从一个反应到另一个反应。因此，该辅酶在细胞中有2种形式:NAD+是一种氧化形式，它从其他分子上获得电子而被还原为NADH;NADH又可被用来做还原剂提供电子。NADH的反应活性中心是l，4－二氢吡啶环，它转移形式上的负氢，将底物还原，而本身被氧化成吡啶盐的形式。这些电子转移反应是NADH的主要功能。NAD+/NADH氧化还原对担当整个反应中氢化物2个电子和1个质子的来源和受体。反应过程见图2。

图2 NAD+/NADH氧化还原反应

该反应是可逆的，意味着辅酶可持续地在两种形式之间循环而没有消耗。

关于辅酶NADH上的负氢转移究竟是通过什么历程完成的，以及负氢将底物还原的机理，长久以来一直是学术界争论的焦点问题。目前普遍被认同的主要有2种机理:一步负氢转移机理(极性机理)，反应不经过自由基中间体过程;以电子转移为先行步骤的多步转移机理(电子转移机理)，它又可分为e－H转移和(e－H+－e)转移2种情况。

Jan Grodkowskl等［1］于1983 年研究了 NAD·/NADH对的单电子转移反应，指出在没有酶参与的情况下，NAD+可能的电子转移的2个步骤为:

其中第1步单电子还原反应已通过脉冲射解作用被研究证实，在中性溶液中测得NAD+/NAD·对的氧化还原电势E= －0.92 V。

由于辅酶NAD+及NADH在生物体内所起到的重要作用，有关它们的研究己经成为生物和化学及其他相关领域的重要课题。人们在关注NADH固有的循环代谢的同时，外来因素对NADH氧化还原反应历程的影响也引起了相关学者的研究兴趣。

2003年Zielonka等［2］在NADH与二溴化物自由基(Br2·－)的氧化反应中，观测到NADH·+自由基阳离子和去质子化形式(NAD·)的存在，说明该反应包含电子转移步骤:

2008年 Ekaterina等［3］指出:NADH 氧化还原反应机理的建立取决于氧化剂，有机氧化剂比如醌类和一些四氮杂苯趋向于一步负氢转移反应路径，而单电子无机氧化剂则趋向于连续的电子转移路径。

可以看到，反应条件的改变和反应物结构的改变都有可能改变反应机理。

2 臭氧对生物分子的作用机理

臭氧(O3)为光化学烟雾中的主要成份，约占90%左右，有强烈的刺激性和氧化性，是现代城市的重要环境污染物之一。O3除来源于交通废气外，还可由许多电器(如电视机、复印机、负离子发生器等)及卫生消毒器材(如紫外线灯、O3消毒保鲜除臭系列产品)产生。

O3的毒性是由于其氧化性所致。被吸入机体后，O3可引起活性氧自由基的产生，与多数细胞组件反应，包括蛋白质、脂肪和DNA等大分子化合物，导致脂质臭氧化作用，使不饱和脂肪酸氧化为脂肪酸的过氧化物，从而造成细胞损害。与此同时，臭氧在医疗卫生方面却有着积极的作用。一方面，臭氧可以对伤口进行杀菌消毒，促进细胞的新陈代谢;另一方面，臭氧也可以用于疾病的治疗。

近年来，多家研究小组致力于研究臭氧对NADH的作用和影响。通过将小鼠暴露在一定浓度的臭氧环境下来检测肺部细胞内 NAD+和NADH的浓度变化，进而揭示臭氧对细胞代谢和生理过程更深入的影响，探究用于疾病治疗时臭氧的作用机理。

臭氧作为一种强氧化剂，本身不是活跃的物种，不像分子氧可以呈现双自由基.O－O.，臭氧可视为O=O－O结构。

1994年William［4］对臭氧在肺部与目标分子反应形成自由基的机理进行了分类研究，指出臭氧本身不是自由基，因它作用产生自由基具有两种完全不同的机理:一个包含臭氧与烯烃的反应;另一个是与给电子体比如谷胱甘肽的反应。

当臭氧与水溶性给电子体作用时，可产生臭氧自由基阴离子，这个短暂的自由基阴离子迅速被质子化，分裂成羟基自由基:

O3/对的还原电势是1.6 V，因此臭氧与硫醇和苯邻二酚类化合物，以及许多其他生物电子供体的电子转移反应是热力学可行的。

1999年Martin等［5］研究了一系列酚类的木质素结构化合物与臭氧反应，发现其自由基形成的速率常数与这些自由基单电子还原反应电势呈线性关系，说明臭氧与这些化合物是通过电子传递而作用的，并提出一种可能的路径(见图3)。

图3 臭氧与芳香族木质素结构的初级反应机理

臭氧与芳香族木质素结构的反应是一个完整的电子转移过程，引发芳香族阳离子自由基和臭氧自由基的形成，质子化作用后臭氧自由基分解得到氧气和羟基自由基。

目前，通过实验对臭氧和NADH直接作用的机理研究还没有相关报道。由于实验条件的限制，大部分研究只涉及到细胞中NADH对臭氧刺激的响应，因此很有必要通过理论模拟手段揭示此反应的作用机理。借助计算机技术、量子化学计算方法和各种动力学理论研究动力学反应的机理及动力学性质不但可对已有的实验研究起到理论补充和证实，而且为进一步的实验研究提供理论依据。

3 采用理论化学方法研究臭氧参与NAD+/NADH氧化还原反应的机理

为了方便研究和阐述辅酶NADH氧化还原反应历程，大量NADH的模型物被合成，以应用于机理研究。本文选取甲基取代烟酰胺环上的腺苷二磷酸核糖的构型来进行机理分析。

基于文献调研，在生物体内存在NADH、NAD·、NAD+三种形式，臭氧参与NAD+/NADH氧化还原反应的总反应为

可能的机理为:

对于该反应体系，主要对步骤(1)的质子转移反应进行直接动力学研究。采用密度泛函方法优化各驻点的几何结构和频率，在优化好的构型下计算能量，根据反应物、中间体、产物的性质寻找设计过渡态，将过渡态优化并计算势能，构建势能面，得到最佳反应路径。

在对NADH进行构型设计时，烟酰胺环上酰胺基上的氢与吡啶环上的活性氢分别呈顺式和反式2种结构(见图4)。臭氧可能与NADH的2种构型均发生反应，所以要同时考虑顺、反结构上的作用情况，并对这2种情况下的反应进行比较。

图4 NADH两种几何构型

对于NAD·→ NAD+的电子转移反应，可以先对NADH、NAD· 、NAD+进行NBO分析，由电荷分布情况为电子转移提供参考依据。

4 结束语

臭氧参与NAD+/NADH氧化还原形式转化的机理研究可为实验提供更多的理论依据，弥补由于实验限制而无法进行的一些瞬态反应，有助于从本质上深入了解臭氧与生物分子相互作用产生自由基的机理和转化规律。在理论方面关于臭氧与生物分子的反应，目前大部分报道都是臭氧加成到不饱和链上或环上，对于参与生物分子氧化还原形式转化的动力学机理还未见报道。因此，该项研究有助于扩充生物反应的理论数据，提升生物反应动力学的研究水平。

［1］Jan Grodkowskl，Neta P，Brian W.Carlson，et al.One-E-lectron Transfer Reactions of the Couple NAD·/NADH［J］.The Journal of Physical Chemistry，1983，87(16):3135－3138.

［2］Jacek Zielonka，Andrzej Marcinek，Jan Adamus，et al.Direct Observation of NADH Radical Cation Generated in Reactions with One-Electron Oxidants［J］.The Journal of Physical Chemistry A，2003，107(46):9860 －9864.

［3］Ekaterina V，Bakhmutova-Albert，Dale W，et al.Chlorine Dioxide Oxidation of Dihydronicotinamide Adenine Dinucleotide(NADH)［J］.Inorganic Chemistry，2008，47(6):2205－2211.

［4］William A P.Mechanisms of Radical Formation From Reactions of Ozone With Target Molecules in the Lung［J］.Free Radical Biology ＆ Medicine，1994，17(5):451－465.

［5］Martin Ragnar，Tord Eriksson，Torbjorn Reitberger，et al.A New Mechanism in the Ozone Reaction with Lignin Like Structures［J］.Holzforschung，1999，53(4):423－428.