胆汁内、外引流术对梗阻性黄疸大鼠小肠黏膜巨噬细胞和TNF-α表达的影响

赵岩，李闻

（中国人民解放军总医院消化科，北京100853）

·论著·

胆汁内、外引流术对梗阻性黄疸大鼠小肠黏膜巨噬细胞和TNF-α表达的影响

赵岩，李闻

（中国人民解放军总医院消化科，北京100853）

目的探讨胆汁内、外引流术对梗阻性黄疸大鼠肠黏膜巨噬细胞及肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达的影响。方法将60只体重300～350 g的成年健康雄性SD大鼠随机分为四组：梗阻性黄疸组(OJ)、胆汁外引流组(ED)、胆汁内引流组(ID)及假手术对照组(SH)。于二次术后第7天留取末端回肠标本。应用免疫组化染色测定大鼠肠黏膜CD68及TNF-α表达的变化。结果四组大鼠模型均成功建立。梗黄时大鼠肠黏膜CD68及TNF-α的表达水平较假手术组明显增强，平均光密度升高[(0.58±0.050)、(0.28±0.034)，P＜0.01；(0.34±0.042)、(0.14± 0.021)，P＜0.01]。黄疸由胆汁内引流术解除后，大鼠肠黏膜CD68的表达与梗阻性黄疸组相比明显减少，平均光密度降低[(0.49±0.049)，P＜0.05]；黄疸由胆汁外引流术解除后，大鼠肠黏膜CD68表达水平减少，平均光密度降低(0.55±0.076)，与梗黄组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。经胆汁内外引流术解除黄疸后，大鼠肠黏膜TNF-α表达受到抑制，平均光密度均降低[(0.29±0.034)、(0.33±0.030)]，但内引流组较梗黄组差异有显著统计学意义(P＜0.01)、外引流组差异则无统计学意义(P＞0.05)。结论梗阻性黄疸时肠黏膜免疫屏障受损，巨噬细胞及细胞因子TNF-α分泌紊乱，胆汁内引流术能显著降低肠黏膜炎症因子的分泌，但胆汁外引流术却不能改善这一状况，提示梗阻性黄疸术前通过胆汁内引流术解除要优于胆汁外引流术。

梗阻性黄疸；胆汁内引流术；胆汁外引流术；肠黏膜；巨噬细胞；肿瘤坏死因子α

梗阻性黄疸是临床常见病、多发病，目前外科手术是解除梗黄的最有效方法，然而围手术期多脏器损伤的发生率和病死率并未随着手术技术的提高而显著下降，其原因除手术创伤和术后并发症外，与梗阻性黄疸肠黏膜屏障功能受损细菌移位引发血内毒素血症紧密相关。但到目前为止，是否选择手术前解除梗阻在外科手术中的意义仍有争议，胆汁内外引流术，哪种引流方式更好，迄今仍无统一意见[1-2]。本实验通过研究胆汁内、外引流术对梗阻性黄疸大鼠小肠黏膜巨噬细胞、肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达的影响，为梗阻性黄疸患者的临床治疗提供更多的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物选择成年健康SD大鼠60只，雄性，体质量300～350 g，由军事科学院实验动物中心提供。

1.2 试剂小鼠抗大鼠CD68抗体(Abcam公司)，兔抗大鼠TNF-α抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，小鼠及兔二步法检测试剂盒及DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 造模与分组保持环境温度15℃～20℃的情况下，将大鼠分笼单独饲养，自由饮食饮水，喂养一周后，随机分为四组，每组各15只。SH组(假手术对照组)：大鼠开腹分离胆总管但并不结扎，饲养7 d后第二次手术，分离大鼠胆总管但并不引流，再饲养7 d后处死留取末端回肠标本。OJ组(梗阻性黄疸组)：大鼠开腹分离胆总管并结扎切断，成功建立大鼠梗阻性黄疸的模型，饲养7 d后二次手术，开腹分离胆总管但并不引流，7 d后处死留取标本。ID组(胆汁内引流组)：大鼠梗阻性黄疸模型建立后，饲养7 d行二次手术，将内引流管植入胆总管的末端和十二指肠间，关腹再饲养7 d后处死留取标本。ED组(胆汁外引流组)：梗阻性黄疸模型成功后，饲养7 d二次手术，将外引流管插入胆管末端，由皮下引至体外颈背部并固定，7 d后处死大鼠并留取标本。

1.4 标本留取以3%戊巴比妥钠(60 mg/kg腹腔内注射)进行大鼠麻醉，开腹取回肠末端全层标本，用冰生理盐水反复冲洗干净，10%福尔马林溶液固定，制成石蜡切块并切片备用。

1.5 免疫组化检测肠黏膜CD68及TNF-α的表达将石蜡切片常规脱蜡至水，磷酸盐缓冲液(PBS）冲洗3次，然后3%H2O2室温孵育20 min后，采用高压锅水浴进行抗原的修复，自然冷却，PBS冲洗3次，每次3 min，随后采用正常山羊血清封闭，室温孵育30 min后，以PBS代替一抗作为对照，滴加一抗，4℃冰箱过夜；再次PBS溶液冲洗3次，每次3 min，滴加二抗，37℃孵育30 min后，用PBS冲洗3次，每次3 min， DAB显色，自来水进行冲洗，苏木素复染，最后常规梯度酒精进行脱水后用常规树脂封片。结果判断：CD68免疫反应阳性主要表达在胞浆，TNF-α免疫反应阳性主要表达在细胞胞浆及胞膜。DAB显色呈棕黄色至深棕黄色颗粒显示为阳性。

1.6 免疫组化图像分析将免疫组化切片与图像分析系统的显微镜相连接(400×)，每1℃张切片随机选择5个视野，应用Image Pro Plus软件测量CD68及TNF-α平均光密度值(OD)，最后求其平均值。

1.7 统计学方法实验数据采用均数±标准差(x-±s)表示，应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，采用单因素方差分析进行多组间比较分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠的一般情况结扎切断大鼠的胆总管后，大鼠全身毛色发黄，大小便发黄，饮食量降低，体重减轻。采用胆汁内引流术解除梗阻后，大鼠饮食及活动增加，体重也显著增加。大鼠行胆汁外引流术解除梗阻后，可看到大量胆汁经外引流管由颈背部排出，但大鼠饮食及活动无变化，体重不变或降低。假手术对照组大鼠的一般情况无明显变化。

2.2 各组肠黏膜CD68及TNF-α免疫组化染色结果镜下CD68胞浆着棕黄色主要分布在小肠黏膜固有层；与SH组比较，OJ组肠黏膜CD68表达明显增多；而与OJ组比较，ED组及ID组肠黏膜CD68表达均降低，且ID组肠黏膜CD68比ED组降低更加明显(图1)。TNF-α免疫反应阳性产物主要分布在肠黏膜的巨噬细胞、浆细胞的细胞浆中。与SH组比较，OJ组肠黏膜TNF-α表达增多；但与OJ组比较，ED组及ID组肠黏膜TNF-α均降低，且ID组降低明显(图2)。

图1 各组肠黏膜CD68表达情况。

图2 各组小肠黏膜TNF-α表达情况

2.3 各组肠黏膜CD68及TNF-α免疫组化染色结果定量分析梗阻性黄疸形成(OJ组)后，CD68、TNF-α表达与SH组比较均显著增加(P＜0.01)。通过胆汁内引流术解除黄疸后，大鼠肠黏膜CD68表达与梗阻性黄疸组相比显著减少(P＜0.05)；行胆汁外引流术解除黄疸后，大鼠肠黏膜CD68受抑制较小，减少程度与梗阻性黄疸组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。通过胆汁内、外引流术解除黄疸，大鼠肠黏膜TNF-α表达均受到抑制，平均光密度均降低，但与梗阻性黄疸组相比内引流显著降低(P＜0.01)、外引流差异无统计学意义(P＞0.05)。各组小肠黏膜CD68、TNF-α表达情况定量分析见表1。

表1 各组大鼠小肠黏膜CD68及TNF-α表达情况

表1 各组大鼠小肠黏膜CD68及TNF-α表达情况

注：与SH组比较，aP＜0.01(F=13.27)，bP＜0.01(F=24.94)；与OJ组比较，cP＜0.05（F=3.98），dP＜0.01（F=6.24）。

组别SH OJ ID ED TNF-α(μg/L) 0.14±0.021 0.34±0.042b0.29±0.034d0.33±0.030例数15 15 15 15 CD68(个) 0.28±0.034 0.58±0.050a0.49±0.049c0.55±0.076

3 讨论

梗阻性黄疸是临床常见综合征，虽然外科手术和重症监护手段不断提高，但围手术期并发症发生率和病死率仍居高不下[3]。这与梗阻性黄疸时肝脏分泌的胆汁不能有效进入肠道发挥生理作用，肠黏膜屏障功能受损，内毒素吸收入血引起肠源性内毒素血症密切相关。

肠黏膜免疫屏障由肠相关淋巴组织(Gut-associated lymphoid tissue，GALT)和弥散免疫细胞组成。许多研究指出梗阻性黄疸后，肠黏膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平显著降低[4]，使肠道黏膜清除细菌与内毒素的能力下降，发生细菌移位和内毒素入血；但关于梗阻性黄疸时肠黏膜巨噬细胞及其分泌因子TNF-α的表达变化鲜有报道，亦未见胆汁内外引流术解除梗阻性黄疸对肠黏膜巨噬细胞及细胞因子TNF-α影响的研究。因此本研究主要探讨梗阻性黄疸时，肠黏膜巨噬细胞及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的变化，及通过胆汁内引流术与外引流术解除梗阻性黄疸后，大鼠肠黏膜巨噬细胞及细胞因子TNF-α的变化，从而探讨胆汁内引流术优于胆汁外引流术的作用机制，为梗阻性黄疸患者的临床治疗提供更多理论依据。

肠道巨噬细胞大多数位于肠黏膜固有层，起着抗原呈递的作用，又具有吞噬细菌的功能，在肠道免疫反应中发挥着重要的作用。同时活化的巨噬细胞可分泌许多细胞因子，主要是肿瘤坏死因子α(TNF-α)，从而激活免疫系统。TNF-α主要由单核-巨噬细胞产生，具有防御和致损伤的双重作用，可作用于细胞膜受体(TNFR P55和P75)，可诱导细胞凋亡、蛋白激酶激活和核转录因子(NF-κB)的激活，从而导致细胞凋亡、炎症发生和纤维组织增生[5]，可诱导IL-1增加，从而增强巨噬细胞的活性，适量分泌具有防御功能，过度则可损伤肠道黏膜，因而巨噬细胞过度激活、活化时造成细胞因子分泌紊乱，反而会造成肠道黏膜损伤。

在本实验中，梗阻性黄疸及胆汁内外引流术解除黄疸的模型均由改良的大鼠手术成功建立[6]，四组大鼠肠黏膜巨噬细胞及TNF-α含量的变化均由免疫组化染色的方法定量测定，采用平均光密度值表示巨噬细胞及TNF-α表达的强弱。实验结果得出，CD68标记的巨噬细胞主要分布在固有层，TNF-α主要分布在炎症细胞的胞浆。巨噬细胞及肿瘤坏死因子TNF-α在假手术对照组少量表达，梗阻性黄疸形成后，两者表达均明显增强，平均光密度值也明显增高，这与其他一些动物及临床实验结果相一致。这些实验表明：梗阻性黄疸时，尽管细胞免疫功能受损，但血清TNF-α炎症细胞因子显著升高[7-10]。梗阻性黄疸由胆汁内引流术解除，大鼠肠黏膜巨噬细胞及TNF-α表达降低，平均光密度值下降，与梗阻性黄疸组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，但梗阻性黄疸由胆汁外引流术解除，大鼠巨噬细胞及TNF-α表达数量仍较高，与梗阻性黄疸组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，从而进一步证明了胆汁内引流术优于外引流术，此结果与我们以前实验解除胆道梗阻可降低血液TNF-α水平，并且内引流优于外引流这一结论相似[11]。梗阻性黄疸时，肠黏膜免疫屏障受损，巨噬细胞细胞免疫紊乱，细胞因子TNF-α过度分泌，TNF-α可诱导肠上皮细胞凋亡和非凋亡细胞的紧密连接使蛋白分解和功能改变，从而导致肠上皮通透性增加，同时可下调跨膜紧密连接前卫蛋白的咬合启动子的表达，导致肠电生理功能发生紊乱[12]，最终使肠道黏膜清除细菌与内毒素能力下降，发生细菌移位和内毒素入学，能加剧梗阻性黄疸术后并发症的发生。

胆汁内外引流术对梗阻性黄疸大鼠肠黏膜巨噬细胞和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达抑制程度不同的准确机制尚不清楚。胆汁有助于食物的消化和营养的吸收，与此同时胆汁内的胆盐可以控制大鼠肠内细菌的繁殖，可以降低肠道内毒素的产生，可以抑制细胞因子的过度分泌，可以有效减少过度的炎症反应[13]。大鼠的肠肝循环可通过胆汁内引流术恢复，但是胆汁外引流术胆汁由大鼠颈背部流向体外，同时因为体外放置外引流管增加了细菌感染的概率。

综上所述，本实验表明梗阻性黄疸时肠黏膜巨噬细胞及TNF-α表达增多，肠黏膜受损，胆汁内引流术可以显著改善这一状况，而外引流术却不能有效降低巨噬细胞及炎症因子的分泌，进一步支持胆汁内引流术优于胆汁外引流术，为梗阻性黄疸患者的临床治疗提供理论依据。

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Effect of internal and external biliary drainages on macrophages and tumor necrosis factor-α levels of intestinal mucosa in rats with obstructive jaundice.

ZHAO Yan,LI Wen.Department of Gastroenterology and Hepatology,the Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,CHINA

ObjectiveTo explore the effect of internal and external biliary drainages on macrophages and tumor necrosis factor-α(TNF-α)levels of intestinal mucosa in rats with obstructive jaundice.MethodsSixty adult healthy male SD rats with the weight of 300～350 g were randomly divided into four groups:obstructive jaundice group (OJ),external drainage group(ED),internal biliary drainage group(ID)and sham operation group(SH).The ileum tissues were taken on the 7th day after the second surgery.Immunohistochemistry was used to determine the expression change of CD68and TNF-α.ResultsFour groups of rats model were successfully established.Compared with SH group,the levels of CD68and TNF-α in rat intestinal mucosa of OJ group were significantly increased,and the mean optical density was increased[(0.58±0.050)vs(0.28±0.037),P＜0.01;(0.34±0.040)vs(0.14±0.021),P＜0.01].Compared with OJ group,the levels of CD68of the ID group significantly decreased and the mean optical density was significantly decreased[(0.49±0.049),P＜0.05)].Compared with the OJ group,the level of CD68of the ED group,was slightly decreased and the mean optical density was slightly decreased,with no statistically significant difference[(0.55±0.076), P＞0.05].The level of TNF-α in both ID and ED groups was reduced.The mean optical density was decreased[(0.29± 0.034),(0.33±0.030)].There was significant difference between ID group and OJ group(P＜0.01).but there was no significant difference between OJ and ED group(P＞0.05).ConclusionAfter common bile duct ligation,the level of macrophages and tumor necrosis factor-α(TNF-α)in intestinal mucosa are significantly elevated in obstructive jaundice. The level of inflammatory cytokines could be reduced significantly by internal biliary drainage in intestinal mucosa of rats with obstructive jaundice,while external biliary drainage had less effect.Internal biliary drainage could be more efficient than external biliary drainage in the relief of intestinal mucosa injury induced by obstructive jaundice.

Obstructive jaundice;Internal biliary drainage;External drainage;Intestinal mucosa;Macrophages;Tumor necrosis factor-α

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.09.0529

R-322

A

1003—6350(2013)09—1249—04

2013-03-01)

国家自然科学基金（编号：30971355）

李闻。E-mail：liwen2000@yahoo.com