新疆葡萄树伤流液抗氧化活性及多酚含量测定

朱富荣，伊力哈木·托合提，艾尔肯·依不拉音，*，黄琼，布热米古丽·买买提

（1.新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆和田师范专科学校生化系，新疆 和田 848000）

伤流液（bleeding sap）是指从受伤或折断的植物组织伤口处溢出液体的现象，是由根压引起的[1]，经剪去葡萄树的部分枝条末梢，直接接葡萄树伤流液，收集简便，而民间将其做为废料弃去，如果将葡萄树伤流液进行开发研究，不仅可防止自然资源的浪费，还有利于开发新的具有生物活性的产品。葡萄树伤流液中含有丰富的营养成分，尤其以钙、钾和谷氨酸含量较高[2]。禹婷等[3]报道以核桃，猕猴桃和葡萄为试材，分析和比较了3 种果树伤流液中游离氨基酸，硝态氮和铵态氮的含量。伊力哈木·托合提等报道了和田葡萄树伤流液具有抗衰老作用[4]，同时阿吉姑·阿布都热西提等报道了葡萄树伤流液的抗氧化活性及热稳定性[5]。而葡萄树伤流液中多酚类物质的研究开发却很少，目前新疆葡萄树伤流液已检测到具有抗氧化、清除羟自由基及热稳定性等活性，原因可能与葡萄树伤流液中的多酚类物质有关。

亚硝胺是目前所知的最强的化学致癌物质之一，它能引起人和动物肝脏等多种器官的恶性慢性肿瘤。正常情况下，人们直接从食物中摄入的亚硝胺极少，但形成亚硝胺的前体物质却大量存在于食物以及产生于食物在体内的代谢过程中，特别是亚硝酸盐在人和动物的胃中更适于合成亚硝胺。因此，清除体内业硝酸盐是防止癌症的有效途径[6]。

1 材料与方法

1.1 材料

葡萄树伤流液：2012 年4 月初采自于和田市、和田县、吐鲁番鄯善县、喀什市、阿图什市，采集后立即冷冻保存，根据需要解冻。

1.2 试剂与仪器

UV-2550 紫外分光光度计：日本岛津；移液器（Genex Beta，100-1000 μL）：上海瑞聪生物科技有限公司；梅特勒电子天平-AG135：梅特勒-托利多仪器有限公司；GSF-250-3 超声清洗器：济宁科源超声波设备有限公司；RE-52A 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

没食子酸标准品（批号：110831-200803）：购自中国药品生物制品检定所；亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、抗坏血酸、乙醇、钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、无水碳酸钠、磷酸、盐酸、溴水等均为分析纯；水为二次重蒸水。

1.3 方法

1.3.1 体外清除·OH 的能力

操作按照南京建成生物工程研究所提供的·OH测试盒说明书进行。在反应体系中加入不同产地的新疆葡萄树伤流液原液0.2 mL，检测体系中·OH 的剩余量，以VC作为阳性对照。最终结果以抑制率表示。

抑制率（%）=（对照管-测定管）/对照管×100%

取三支10 mL 比色管a、b、c，准确吸取一定量5 μg/mL 的NaNO2溶液两份，分别加入到a 和c 管中，吸取6 mL 葡萄树伤流液原液，分别加入到a 和b 管中，反应10 min 后，a、b、c 管中分别加入0.4%的对氨基苯磺酸溶液2.0 mL，摇匀反应5 min，再都加入0.2%的盐酸萘已二胺1.0 mL，摇匀15 min 后，在最大吸收波长538 nm 处，以b 管为参比测得a 管的吸光度为A，以试剂空白为参比测得c 管的吸光度为A。按下式计算葡萄树伤流液对亚硝酸钠的清除率：清除率=[（Ao-A）/Ao]×100%，式中Ao为未加提取液亚硝酸钠的吸光度，A 为加提取液后亚硝酸钠的吸光度。

1.3.3 Folin-Ciocalteu 比色法测定葡萄树伤流液中总多酚含量

1.3.3.1 最佳测定波长的选择

取0.05 mg/mL 没食子酸标准溶液及浓缩的样品液各0.5 mL 于10 mL 的棕色容量瓶中，各加入0.5 mL Folin-Ciocaltou 试剂（按药典的方法配制），加入3 mL水摇匀后，放置4 min，再加入1.5 mL 10% Na2CO3溶液，蒸馏水定容至刻度，避光静置120 min，用分光光度计在400 nm～800 nm 波长范围内分别扫描没食子酸标准溶液与处理样品液的吸收光谱，确定其最大吸收波长为760 nm。

1.3.3.2 各试剂用量的选择

取0.05 mg/mL 没食子酸标准溶液0.4 mL，分别加入0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL Folin-Ciocalteu 试剂，混匀后分别加入3 mL 蒸馏水，4 min 后各加入1.5 mL 10%Na2CO3溶液，并定容至10 mL，显色后测定其吸光度值，以确定Folin-Ciocalteu 显色剂的用量，实验结果表明，随着Folin-Ciocalteu 试剂的增加，吸光度不断升高，当吸取量达到0.5 mL 时吸光度趋于稳定，因此选择加入0.5 mL 的Folin-Ciocalteu 试剂。

取0.05 mg/mL 没食子酸标准溶液0.4 mL，分别加入0.5 mL Folin-Ciocalteu 试剂，混匀后分别加入3 mL蒸馏水，4 min 后分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 10%Na2CO3溶液，并定容至10 mL，显色后测定其吸光度值，以确定10%Na2CO3溶液的用量。实验结果表明，随着Na2CO3溶液的增加，吸光度是先升高后略有下降，当加入1.5 mL Na2CO3溶液时吸光度最大，因此选择加入1.5 mL 的10%Na2CO3溶液。

1.3.3.3 显色时间的选择

精密移取0.05 mg/mL 没食子酸标准溶液0.4 mL于10 mL 的容量瓶中，加入磷钼钨酸试液0.5 mL，再分别加水3 mL，10%碳酸钠溶液1.5 mL，蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置4 分钟以相应的试剂为空白，分别反应10、30、60、90、120、150、180 min 在760 nm 处测定吸光度。实验结果表明，120 min 以后吸光度趋于稳定，考虑到效率问题，因此显色时间选择120 min。

1.3.3.4 测定方法

精密量取葡萄树伤流液浓缩液（20 倍）0.4 mL，置于10 mL 棕色容量瓶中，加入磷钼钨酸试液0.5 mL，再加蒸馏水3 mL，摇匀，放置4 min 再加10%碳酸钠溶液1.5 mL，蒸馏水定容至刻度，放置120 min 后，以相应的试剂为空白，依照紫外-可见分光光度法，在760 nm 的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.3.5 标准曲线的建立

精密量取0.05 mg/mL 没食子酸标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分别置10 mL 棕色量瓶中，以下同上。

1.3.3.6 稳定性试验

对Folin-Ciocalteu 比色法测定新疆葡萄树伤流液进行稳定性试验，反应完全后，避光下放置0、0.5、1、2 和3 h 后测定的吸光值分别为0.770、0.772、0.778、0.779、0.779。结果表明，该方法在体系反应完全后放置3 h 内测定值仍比较稳定，其相对标准偏差（RSD）为0.556%。

1.3.3.7 精密度试验

对Folin-Ciocalteu 比色法测定新疆葡萄树伤流液多酚进行精密度实验，同一样品测定6 次，其吸光值分别为0.353、0.354、0.354、0.354、0.353、0.354，其吸光度值的RSD 为0.147%，表明该方法具有较高的精密度，所测结果可靠。

1.3.3.8 重现性试验

对Folin-Ciocalteu 比色法测定葡萄树伤流液多酚进行重现性试验同一批样品6 份，测定的吸光度值分别为0.339、0.331、0.336、0.352、0.342、0.344.其吸光度值的RSD 为2.11%，表明该法具有良好地重现性。

1.3.3.9 加标回收率试验

取样品浓缩液0.2 mL，置于9 个10 mL 的容量瓶中，再分别分加入220、280、340 μg 对照品溶液（0.05 mg/mL），按“1.3.4.4”标准曲线项下的方法，显色后避光放置120 min，测定吸光度，计算回收率，结果回收率的范围为96.43%～104.73%。

2 结果与分析

2.1 9 种葡萄树伤流液清除·OH 能力

按“1.3.1”项下的方法，测定9 种新疆葡萄树伤流液清除羟自由基的能力，结果见表1。由表1 可知，除吐鲁番的无核白、卡西克、白加克外，其余6 个品种的新疆葡萄树伤流液的抑制率均大于90%，抑制率越大，间接反映了抗氧化活性越强。

2.2 9 种新疆葡萄树伤流液清除的能力

表1 葡萄树伤流液清除·OH 和的能力测定Table 1 Hydroxyl radicals and nitrite scavenging ratios of Bleeding sap of Grape tree

2.3 样品总多酚的含量测定结果

2.3.1 标准曲线的建立

按照“1.3.3.5”项的方法绘制标准曲线如图1 所示。

图1 标准曲线Fig.1 Standard curve

由图1 可知，回归方程为y=0.122 8x+0.029 5，相关系数R2为0.999 7，结果表明：没食子酸的浓度在0～6 mg/L 范围内与吸光度有良好的线性关系。通过回归方程及样品浓缩液测定的吸光度，可计算出样品浓缩液的浓度，进一步可以得到各个品种的葡萄树伤流液的多酚含量。

2.3.2 9 种葡萄树伤流液的总多酚含量测定结果

精密吸取各样品的浓缩液（20 倍）0.4 mL，按标准曲线绘制项下的方法，显色后避光放置120 min，测定样品的吸光度值，结果见下表2。

从表2 检测结果得知，不同品种葡萄树伤流液中的总多酚含量是不同的，即使是同一个产地的不同品种的葡萄树伤流液中的总多酚含量也是不同的，总多酚含量在不同品种新疆葡萄树伤流液中有较大差异，其范围为2.64 mg/L～6.76 mg/L，其中吐鲁番地区不同品种的葡萄树伤流液总多酚含量相对较高，和田地区不同品种的葡萄树伤流液总多酚含量差异较大。

表2 新疆葡萄树伤流液总多酚含量Table 2 The Polyphenol content of Bleeding sap of Xinjiang Grape tree

3 结论

3）系统研究了以没食子酸为标准品，Folin-Ciocalteu 比色法测定新疆葡萄树伤流液中总多酚的含量。此方法具有操作简便、精密度高、结果准确可靠等优点，可用于新疆葡萄树伤流液中总多酚含量的测定。品种间含量的差异，是由于Folin-Ciocalteu 法测出的是多酚类化合物的相对总量，受多酚物质的结构和性质影响很大，不同种植环境、不同种植品种的新疆葡萄树伤流液的总多酚的含量是有差异的。

4）新疆9 种葡萄树伤流液清除·OH 的能力大小和多酚含量的多少并不成明显的比例关系，可能葡萄树伤流液中的多酚并不是唯一的抗氧化活性物质。

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