阿萨希毛孢子菌顶体观察

吕运通，王文岭，杨蓉娅，夏志宽，李海涛

阿萨希毛孢子菌( Trichosporon asahii, T. asahii)是毛孢子菌属中常见的深部致病菌，在免疫功能低下的宿主可导致致命的系统感染，但目前对其生长发育特点、致病机制尚不十分清楚。1957 年，Girbardt[1]在光学显微镜下，观察到位于菌丝顶端（hyphal tip）有一小的、易染色的球状小体，这个球状体被称为顶体，与菌丝生长有着密切关系，顶体已经在构巢曲霉[2,3]、烟曲霉[4,5]等多种真菌中被证实。T. asahii 在生长过程中可以出现孢子、芽胞、芽管、菌丝、关节菌丝等多种结构[6]，这些结构的形成与顶体有什么关系，我们对此进行了观察，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

T. asahii（CBS 2479，购自荷兰CBS 公司）由日本千叶大学医学研究中心惠赠，-80℃保存。FM4-64 荧光染剂（美国Biotium 公司，激发波长为543 nm），二甲基亚砜（DSMO）（美国Sigma 公司），细胞松弛素D（以色列Fermentek 公司）。leica dm3000荧光数码拍摄系统，滤光片LP560 (Ex543/Em560)。

1.2 方法

1.2.1 菌液制备和培养

取浓度为106/ml 的T. asahii 菌悬液2 ml 分别转种于7 份30 ml 无菌YPD 液体培养基中，37 ℃，150 r/min 培养72 h。

1.2.2 T.asahii 顶体观察 将FM4-64 溶解在DSMO中，终浓度为1.64 mmol/L。取0.5 ml 的菌悬液，加入2 μl 溶解好的FM4-64，孵育10 ～20 min，3 000 r/min 离心5 min，弃上清，加0.5 ml PBS 清洗2 次，3 000 r/min 离心5 min，取少量底层悬浊液涂片。在滤光片LP560（Ex543/Em560） 或LP505（Ex488/Em518）荧光显微镜下观察。

1.2.3 不同浓度的细胞松弛素D 对T.asahii 的抑制 取浓度106/ml 的 2 ml T. asahii 菌液分别转种于4 份30 ml 无菌YPD 培养基中，加入细胞松弛素D 分别致终浓度：0.5，1，2 μmol/L，不加细胞松弛素D 的为对照组。37 ℃，150 r/min 培养72 h。荧光染色后在荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 T.asahii 顶体观察

孢子和芽胞顶端有较明显的荧光（图1a，1b），部分芽管的两端可见明显的荧光（图1c，1d），菌丝顶端可见荧光（图1e，1f）。除了可观察到菌丝明显荧光，偶可见到假菌丝的一端有明显的荧光（图1g），部分假菌丝两端同时出现荧光（图1h），同时观察到链珠状孢子内较弥散较明显的荧光（图1i）。

2.2 细胞松弛素D 对T.asahii 生长的影响

对照组菌丝生长良好，细长形，其顶端和近顶端可见明显的荧光（图2a，2b），经不同浓度的细胞松弛素D 处理后的T.asahii，菌丝生长受到明显的抑制，顶端荧光消失，荧光散在其体内。

细胞松弛素D 的浓度为0.5 μmol/L 时，菌丝增粗，顶端及近顶端未见明显的荧光（图2c，2d）；1 μmol/L 时，菌丝进一步缩短，其体内荧光点状散在分布（图2e，2f）；2 μmol/L 时，菌丝呈现芽管形态，其体内荧光少量聚集或散在（图2g，2h）。

3 讨论

图1 T.asahii 各种生长结构中的顶体（荧光显微镜×100）

图2 细胞松弛素D对T.asahii生长影响（×100）

细胞极性的确立和维持，在真核生物的形态发生过程中发挥着至关重要的作用。极性生长的模式在生物界中普遍存在，如丝状真菌的菌丝、苔藓及蕨的原丝体、植物的花粉管和根毛、动物的神经细胞等。真菌的分生孢子萌发后，萌发管沿单一方向连续生长即顶端生长，以发育成为成熟的菌丝。在此过程中伴随着细胞核的分裂，细胞质并不同步分裂。大多数真菌中，连续的几次核分裂之后， 细胞质才发生一次分裂，在远离菌丝顶端的一侧形成隔，顶端细胞中的多个细胞核以非同步化的方式继续分裂，在成熟的菌丝中一个细胞内通常存在多个细胞核。丝状真菌菌丝的生长，与其他植物极性细胞生长一样，以细胞的顶端生长为特征，其生长仅限于菌丝顶端的穹窿区域，在直径均匀的后部管状区域则几乎不再伸长。菌丝的顶端生长方式在一个世纪前已被发现，随后的研究对此进行了进一步阐述，指出菌丝的生长速率在顶端最大，距端l pm 处胞壁的合成速率可能是50 pm 处的50 倍，而在伸长区的基部，生长速率可能降为零。

Grove 等[7]利用冷冻置换电子显微镜证实了顶体是一种富含分泌囊泡的小体，Bartnicki- Garcia 等[8]提出囊泡供给中心模型（the vesicle supply center model，VSC），并且指出分泌囊泡在顶体集聚，然后被运送到细胞表面，与细胞膜融合并且释放分泌囊泡里面的物质，计算机模型显示在细胞表面的分泌囊泡呈现浓度梯度分布。

顶体的主要结构为分泌囊泡（secretory vesicles），顶体在功能上一般认为与微管组织中心(microtubule organizing center，MTOC) 有关。 在动物细胞中，MTOC 是中心体，中心体可随细胞周期进行复制，并且在分裂期形成纺锤体的两极；在真菌细胞中，MTOC 是纺锤体极体(spindle pole body，SPB)，MTOC 位于顶体之内，已经通过免疫定位技术在巨雌异水霉（Allomyces macrogynus）得到证实[9]。顶体内聚集的分泌囊泡起着运送菌丝极性生长所需物质的作用，通过对真菌囊泡为基础的数学模型的观察，发现顶体就是一个涉及到细胞膜扩张的可移动囊泡的中心[10]。Reynaga-Peña 等[11]已经通过实验证实改变顶体的位置可以改变菌丝生长的方向，这就印证了Girbardt 所提出顶体可以控制菌丝生长方向的假说。

FM4-64 是两性苯乙烯基荧光染料，这种染料有比较好的耐光性和较小的细胞毒性，通过细胞膜的内吞作用透过细胞膜分布在分泌小泡膜的表面[12]。我们应用两性苯乙烯基荧光染料FM4-64 对T. asahii进行了观察研究，发现：①在芽胞、芽管、假菌丝、菌丝的近顶端都可以观察到顶体这一结构表现出来的较强荧光。②假菌丝的两端有时会同时出现较强的荧光，而在菌丝中这种现象是不存在的，可以推测假菌丝的生长也是受顶体所调控，这和其他真菌存在差异，从而提示T. asahii 的假菌丝尚有转化生长为菌丝的可能。在串珠状孢子的体内荧光散在分布，提示此时的T. asahii 不具备或已经丧失了极性生长的能力，或者正在孕育下一次的出芽。③加入细胞松弛素D 抑制顶体形成后，可以看到菌丝形成和生长受到显著抑制。随着细胞松弛素D 浓度的提高，菌丝形成的抑制越来越显著，直至菌丝形成完全抑制，只能形成粗短的芽管，这一现象表明细胞松弛素D 能够通过抑制分泌囊泡的转运，从而抑制顶体的形成。

[1] Girbardt M. Der Spitzenkörper von Polystictus versicolor [J]. Planta, 1957, 50(1):47-59.

[2] Jackson-Hayes L, Hill TW, Loprete DM, et al. GDP-mannose transporter paralogues play distinct roles in polarized growth of Aspergillus nidulans [J]. Mycologia, 2010, 102(2):305-310.

[3] Higashitsuji Y, Herrero S, Takeshita N, et al. The cell end marker protein TeaC is involved in growth directionality and septation in Aspergillus nidulans [J]. Eukaryot Cell, 2009, 8(7):957-967.

[4] Li Y, Zhang L,Wang D, et al. Deletion of the msdS/AfmsdC gene induces abnormal polarity and septation in Aspergillus fumigatus [J]. Microbiology, 2008, 154(Pt7):1960-1972.

[5] Li H, Barker BM, Grahl N, et al. The small GTPase RacA mediates intracellular reactive oxygen species production, polarized growth, and virulence in the human fungal pathogen Aspergillus fumigatus [J]. Eukaryot Cell, 2011, 10(2):174-176.

[6] Wang WL, Yang RY, Ao JH, et al. Uncommon characteristics of the structure and development of Trichosporon asahii [J]. Chin Med J, 2009, 122(15):1806-1810.

[7] Grove SN, Bracker CE. Protoplasmic organization of hyphal tips among fungi: Vesicles and Spitzenkörper [J]. J Bacteriol, 1970, 104(2):989-1009.

[8] Bartnicki-Garcia S, Hergert F, Gierz G. Computer-simulation of fungal morphogenesis and the mathematical basis for hyphal (tip) growth [J]. Protoplasma, 1989, 153(1-2):46-57.

[9] Virag A, Harris SD. The Spitzenkörper：a molecular perspective [J]. Mycol Res, 2006, 110 (Pt1):4-13.

[10] Straube A, Brill M, Oakley BR, et al. Micro-tubule organization requires cell cycle-dependent nucleation at dispersed cytoplasmic sites: polar and perinuclear microtubule organizing centers in the plant pathogen Ustilago maydis [J]. Mol Biol Cell, 2003, 14(2):642-657.

[11] Reynaga-Peña CG, Gierz G, Bartnicki-Garcia S. Analysis of the role of the Spitzenkörper in fungal morphogenesis by computer simulation of apical branching in Aspergillus niger [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(17):9096-9101.

[12] Fischer-Parton S, Parton RM, Hickey PC. Confocal microscopy of FM4-64 as a tool for analysing endocytosis and vesicle trafficking in living fungal hyphae [J]. J Microsc, 2000, 198(3):246-259.