高效耐高温石油降解菌降解石油的促进因子研究

刘海涛,张云波,吴文华,赵雅坤

(1.中国石油大学(华东)环境与安全工程系,山东青岛266580;2.昌乐县环保局,山东潍坊262499)

高效耐高温石油降解菌降解石油的促进因子研究

刘海涛1,张云波1,吴文华2,赵雅坤1

(1.中国石油大学(华东)环境与安全工程系,山东青岛266580;2.昌乐县环保局,山东潍坊262499)

将耐高温石油降解菌UM6-3菌悬液接种于100 m L石油MSM中,在47.5℃下振荡培养6 d。分别考察环境因子中的初始p H值、石油含量、振荡器转速,营养平衡因子中的氮源、氮磷比,生物因子中的接种量、酵母粉添加量对石油降解的促进作用。基于单因素实验结果,设计初始p H值、接种量、氮磷比、石油含量、振荡器转速的5因素4水平正交实验,结果表明,影响石油降解的主要因子是振荡器转速和接种量,初始p H值的影响最小;UM6-3降解石油的最佳促进因子为:初始p H值7,接种量4 m L,氮磷比5∶1,石油含量1%,振荡器转速140 r·min-1。

石油降解;耐高温;促进因子;营养平衡

随着新疆成为我国油气资源战略接替区,大漠荒滩的石油开发如火如荼,随之带来的石油污染问题日益严重。新疆地区夏季高温干旱,迫切需要高效的耐高温石油降解菌进行生物修复。作者分别研究了环境因子、营养平衡因子、生物因子对高效耐高温石油降解菌UM6-3降解石油的促进作用,并确定了UM6-3降解石油的最佳促进因子,拟为高温干旱环境的生物修复提供依据。

1 实验

1.1 材料与仪器

石油:采自新疆百口泉井区,密度0.792 g· cm-3,粘度1923.14 mPa·s(50℃),饱和烃含量71.17%,芳香分含量18.42%,胶质含量9.89%,沥青质含量0.52%。

OIL-510型全自动红外分光测油仪,北京华夏科创仪器技术有限公司;ZQ-HA型水浴振荡器,哈尔滨东联电子技术开发有限公司。

1.2 菌种与培养基

菌种:通过紫外-微波复合诱变得到3株耐高温石油降解菌,分别为红球菌属、假单胞菌属和芽孢杆菌属,复配得到高效耐高温石油降解混合菌UM6-3,其最适生长温度为47.5℃,能够耐受65℃高温,最适培养时间为6 d。

无机盐培养基(MSM):Na2HPO40.6 g, KH2PO40.2 g,Na NO34.0 g,MgSO40.3 g,CaCl20.01 g,FeSO40.01 g,酵母粉0.5 g,蒸馏水1000 m L,p H值7.0。

1.3 方法

将UM6-3菌悬液接种于100 m L石油MSM中,在47.5℃下振荡培养6 d,分别考察环境因子中的初始p H值、石油含量、振荡器转速,营养平衡因子中的氮源、氮磷比(N∶P,质量比,下同),生物因子中的酵母粉添加量、接种量对石油降解的促进作用。

基于单因素实验结果,以初始p H值、接种量、氮磷比、石油含量、振荡器转速为考察因素,以石油降解率为考核指标,进行5因素4水平正交实验,以期获得UM6-3降解石油的最佳促进因子。正交实验的因素和水平见表1。

1.4 石油降解率的测定

初始石油含量依据培养基添加石油前后的质量计算获得。

培养后培养基中的石油含量,依据GB/T 16488 -1996《水质、石油类和动植物油的测定 红外光度法》用全自动红外分光测油仪测定,并稍作改进:培养基中的石油经UM6-3降解后变为微小絮体,萃取液通过铺有无水Na2SO4的砂芯漏斗脱水时极易堵塞,因此用循环水式真空泵将萃取液抽入抽滤瓶中,为了保证脱水效果,将无水Na2SO4的厚度增加至15 mm[1]。

表1 正交实验的因素和水平Tab.1 The factors and levels of orthogonal experiment

2 结果与讨论

2.1 环境因子对UM6-3降解石油的促进作用

2.1.1 初始p H值

微生物的生命活动、物质代谢与p H值有密切的关系[2,3]。p H值对微生物生命活动的影响主要有:一是引起细胞内大分子蛋白质、核酸电荷的变化从而导致细胞活性变化;二是p H值过高会对降解菌的生长和降解酶的分泌及其活性产生不利影响,而p H值过低时,氢离子浓度超过微生物酶的适应范围,又使微生物原生质膜的电荷发生变化,从而改变微生物吸收营养物质的能力;三是改变营养物质的可给性和毒性物质的毒性。一般认为,低p H值会影响氮的转化,当p H值稍高于中性时,对硝化作用和氮的进一步转化有利,且磷的有效性在p H值6～8时最高。

初始p H值对UM6-3降解石油的促进作用见图1。

图1 初始p H值对石油降解的促进作用Fig.1 The promotion effect of initial p H value on petroleum degradation

由图1可知,偏碱性环境对UM6-3的石油降解效果有明显的促进作用。在初始p H值为5～11的范围内,随着初始p H值的增大,UM6-3的石油降解率先上升后下降,在初始p H值为8时最高,为62.49%。表明UM6-3具有很强的酸碱耐受性,在初始p H值6～10的环境中,石油降解率均超过50%。

2.1.2 振荡器转速

振荡器转速主要是影响培养过程的溶解氧含量[4,5]。微生物降解石油烃的途径虽然不同,但是在降解过程中都需要大量的电子受体。氧是微生物好氧呼吸的最终电子受体,在生物降解过程中有两个作用: (1)参与生物修复过程中部分物质合成,利用氧化过程抵抗产生的有毒物质;(2)参与甾醇类和不饱和脂肪酸的合成。据计算,降解1 g石油需要0.3～0.4 g氧气。因此,提高振荡器转速可以增加溶解氧含量,还可以增加微生物细胞与石油烃的接触机会,从而促进微生物降解石油,但过高转速造成的剪切作用会对细胞造成损伤,反而会抑制石油的降解。振荡器转速对UM6-3降解石油的促进作用见图2。

图2 振荡器转速对石油降解的促进作用Fig.2 The promotion effect of rotation speed on petroleum degradation

由图2可知,UM6-3的石油降解率随振荡器转速的增大先上升后下降,在振荡器转速为140 r·min-1时最高,为65.58%。

2.1.3 石油含量

石油含量是影响微生物降解的主要因素之一。石油含量太低对降解菌的存活、维持降解所必需的降解菌的数量以及诱导微生物降解酶的产生都是不利的;但石油含量过高时又会影响细胞与周围环境的物质交换,并对微生物产生毒性,还会在培养基表面形成油膜,影响氧气向培养基中扩散,导致微生物的生长繁殖因缺氧而受到抑制。只有当石油含量适宜时才能诱导微生物降解酶的产生,达到好的降解效果[6]。石油含量对UM6-3降解石油的促进作用见图3。

由图3可知,随着石油含量的增加,UM6-3的石油降解率先逐渐上升后显著下降,在石油含量为3%时最高,为67.29%。

图3 石油含量对石油降解的促进作用Fig.3 The promotion effect of petroleum content on petroleum degradation

2.2 营养因子对UM6-3降解石油的促进作用

研究表明营养元素是影响微生物降解石油污染物的关键因素[7]。只有环境中的营养元素满足微生物生长代谢的需要时,微生物才能充分发挥降解石油的能力,从而提高石油污染物的降解效果。

2.2.1 氮源

氮是微生物生长必需的营养元素[8],也是影响石油降解菌降解效率的重要营养物质。氮源对UM6-3降解石油的促进作用见图4。

图4 氮源对石油降解的促进作用Fig.4 The promotion effect of nitrogen source on petroleum degradation

由图4可知,总体来说,无机氮源优于有机氮源,铵态氮优于硝态氮,酰胺态氮最次。其中NH4Cl作为氮源时,UM6-3的石油降解率最高,达到68.47%,明显高于Na NO3作为氮源的61.25%,促进作用明显。这是因为,有机氮源同时作为碳源,将优先于石油组分被UM6-3利用,从而妨碍了石油降解效果,同时铵态氮水解具有缓冲作用,利于保持培养基p H值的稳定。

2.2.2 氮磷比

碳和氮是构成菌体成分的重要元素,它们与主要的无机营养元素磷之间需满足一定比例,若比例失调,就会影响微生物的正常生长繁殖,使微生物的生物活性及各种性能受到影响[9],因此氮磷比是石油降解中重要的控制条件之一。氮磷比对UM6-3降解石油的促进作用见图5。

图5 氮磷比对石油降解的促进作用Fig.5 The promotion effect of nitrogen-phosphorus ratio on petroleum degradation

由图5可知,随着氮磷比的增大,UM6-3的石油降解率先显著上升后逐渐下降,在氮磷比为5∶1时最高,为67.01%。

2.3 生物因子对UM6-3降解石油的促进作用

2.3.1 接种量

微生物的种类和数量[10]对石油降解的影响较大。接种量太少,细菌生长的延迟期较长,石油降解的启动时间延后,不利于石油降解;而接种量太多,又会引起营养物质的竞争,导致单个菌体得不到足够的营养物质,同样不利于石油降解。接种量对UM6-3降解石油的促进作用见图6。

图6 接种量对石油降解的促进作用?Fig.6 The promotion effect of inoculum amount on petroleum degradation

由图6可知,随着接种量的加大,UM6-3的石油降解率先显著上升后有所下降,在接种量为4 m L时最高,为67.36%。

2.3.2 酵母粉添加量

大量研究证明酵母粉在生物降解中发挥着积极的作用,能提供微生物生长所需的碱基、嘌呤、嘧啶等生长因子和微量营养元素[11,12],但酵母粉添加量过多时,其中所含的有机物又会妨碍微生物对石油的利用。酵母粉添加量对UM6-3降解石油的促进作用见图7。

图7 酵母粉添加量对石油降解的促进作用Fig.7 The promotion effect of yeast powder addition amount on petroleum degradation

由图7可知,培养基中加入酵母粉后,UM6-3的石油降解率先迅速上升后逐渐下降,在酵母粉添加量为1 g·L-1时最高,为65.34%。

2.4 正交实验

正交实验的结果与分析见表2。

表2 正交实验的结果与分析Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiment

由表2可知,各因素对UM6-3降解石油效果的影响大小依次为:振荡器转速＞接种量＞石油含量＞氮磷比＞初始p H值,主要影响因子是振荡器转速和接种量,初始p H值的影响最小。确定了最佳组合为: A1B3C2D1E3,即最佳促进因子为:初始p H值7,接种量4 m L,氮磷比5∶1,石油含量1%,振荡器转速140 r·min-1。

3 结论

将耐高温石油降解菌UM6-3菌悬液接种于100 m L石油MSM中,在47.5℃下振荡培养6 d。通过单因素实验研究了环境因子中的初始p H值、振荡器转速、石油含量,营养平衡因子中的氮源、氮磷比以及生物因子中的接种量、酵母粉添加量对UM6-3降解石油的促进作用。正交实验表明,影响石油降解的主要因子是振荡器转速和接种量,初始p H值的影响最小;确定UM6-3降解石油的最佳促进因子为:初始p H值7,接种量4 m L,氮磷比5∶1,石油含量1%,振荡器转速140 r·min-1。

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Study on the Promotion Factors for Degradation of Petroleum by High Efficient Thermostable Petroleum Degrading Bacteria

LIU Hai-tao1,ZHANG Yun-bo1,WU Wen-hua2,ZHAO Ya-kun1
(1.Department of Environmental and Safety Engineering,China University of Petroleum, Qingdao 266580,China;2.Changle Enviromental Protection Bureau,Weifang 262499,China)

UM6-3 Bacteria were seeded in the 100 m L of petroleum MSM,and cultured for 6 d with shaking under the temperature of 47.5℃.The environmental factors(such as initial p H value,petroleum content,rotation speed),nutritional balance factors(such as nitrogen source,nitrogen-phosphorus ratio)and biological factors(inoculum amount and yeast powder addition amount),which may promote the effect of petroleum degradation,were studied.Based on the single factor experiment results,the L16(54)orthogonal experiment was designed for the factors including initial p H value,inoculum amount,petroleum content,nitrogen-phosphorus ratio and rotation speed.The results showed the main factors affecting the petroleum degradation were rotation speed and inoculum amount,initial p H value was inferior.For UM6-3,the optimum promoting factors were as follows:initial p H value of 7,inoculum amount of 4 m L,N∶P of 5∶1,petroleum content of 1%,rotation speed of 140 r·min-1.

petroleum degradation;thermostable;promotion factor;nutritional balance

Q 939.97

A

1672-5425(2013)03-0039-05

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.03.010

中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(11CX06048A)

2012-12-26

刘海涛(1987-),男,河南洛阳人,硕士研究生,研究方向:生物技术在环境保护中的应用;通讯作者:张云波,副研究员, E-mail:zyb0065@163.com。