利用荧光素酶标记的肿瘤细胞建立活体成像动物模型

张绘宇,　郑国兵,　张金栋,　刘启才

(1.广州医学院 病理教研室，　广州　510182； 　2.广州医学院 实验医学研究中心，　广州　510182)

0　引言

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，在我国许多大中型城市, 乳腺癌已居女性恶性肿瘤死亡率的首位。乳腺癌复发转移是导致乳腺癌患者死亡的最主要原因，淋巴结阴性的患者中约有24%～30%出现复发转移，淋巴结阳性的患者中复发转移率高达50%～60%，而转移性乳腺癌的5年生存率仅为26%[1]。寻找有效的药物用于转移性乳腺的治疗是目前迫切需要解决的难题。

萤火虫荧光素酶(Luciferase)是一种常用的信号分子，可以用来标记肿瘤细胞[2-4]。使研究人员能够通过活体成像系统直接观察细胞在体内的生长、转移及对药物的反应等。特别是在肿瘤的研究中，能够无创伤定量对动物体内的原位癌、转移癌进行直接快速检测和测量[5]。本研究将带有荧光素酶报告基因的真核表达重组质粒pRc/CMV2-luc转染人乳腺癌细胞株MCF-7，利用G418筛选，获得稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆(MCF-7-luc),并在体外评价其发光能力。通过建立裸鼠移植瘤模型，利用活体生物发光成像系统检测肿瘤生长及转移情况，为下一步监测裸鼠移植瘤对药物作用的变化情况，从而为分析药物对肿瘤的治疗效果提供理想的实验动物检测平台[6-7]。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1试剂和仪器

DMEM/F12培养基、胎牛血清、G418和LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；Luciferase Assay System和Luciferin (in vivo Grade)购自美国Promega公司；细胞计数仪Z2 coulter购自美国BECKMAN COULTER公司；荧光素酶检测系统GLOMAX 96 micro plate luminometer购自Promega公司；活体成像系统Night OWLⅡ LB983 NC100购自德国Berthold公司。

1.1.2细胞和动物

人乳腺癌细胞株MCF-7和重组质粒pRc/CMV2-luc由广州医学院实验医学研究中心提供[8]；4～5周龄BLAB/c nu/nu裸鼠购自广东省医学实验动物中心(SCXK(粤)2008-0002)。

1.2　方法

1.2.1G418最佳筛选浓度的确定

MCF-7细胞常规培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基。取对数生长期MCF-7细胞，按每孔1×104个接种于12孔板中，置于5% CO2、饱和湿度、37℃细胞培养箱中常规培养。G418按0、200、400、600、800、1000 μg/ml设置6个浓度梯度。在细胞接种24 h后，加入孔板中，每个浓度设置2个复孔。每天观察细胞生长情况，在10～14 d 内全部死亡的最低G418浓度，即为筛选质粒转染克隆MCF-7细胞的浓度。

1.2.2细胞转染

取对数生长期的MCF-7细胞，将细胞接种于6孔培养板中，24 h内待细胞融合度达到80%～90%即可转染。按照LipofectamineTM2000试剂盒操作指南进行转染。在250 μl无血清、无双抗的DMEM培养基中加入8 μg/ml的pRc/CMV2-luc质粒，在 250 μl 无血清、无双抗的DMEM培养基中加入 10 μl LipofectamineTM2000，室温培育5 min。将上述2种稀释液混匀，室温培育30 min后加入细胞孔板中，置于培养箱常规培养。

1.2.3单克隆细胞筛选

转染24 h后胰酶消化细胞并按1∶6比例接种到新6孔板中，同时加入实验确定的浓度G418，随后每2 d更换一次培养基并维持G418筛选直至单细胞抗性克隆的出现。分别挑选单一抗性克隆至96孔板，待其逐渐增殖后转入24孔板中继续传代培养。

1.2.4荧光素酶活性鉴定阳性克隆

单一抗性克隆传代至第五代时用Luciferase Assay Aystem检测荧光素酶活性。检测时，各克隆按1×105个/孔接种到24孔板，24 h后细胞裂解液裂解，收集裂解物，12 000 rpm,4℃离心10 min，取上清10 μl加入96孔白板中，向每孔加入50 μl荧光素酶底物，停留2 s后，96 microplate luminometer连续读取10 s的荧光值(RLU)，每个克隆设3个复孔，保留RLU值高的细胞克隆继续传代培养，再过5代后进行荧光素酶活性检测。保留RLU值维持较高的克隆直至第30代，荧光素酶活性最高的几个克隆MCF-7-luc即为阳性克隆。

1.2.5各不同数量细胞克隆的荧光值检测

将筛出的MCF-7-luc阳性克隆细胞按细胞数4×104、2×104、1×104、5000、2500、1250、625、312和156分别接种到96孔黑板中，另外一组仅有细胞，一组仅有培养基作对照，设置2个复孔，常规培养24 h后，去上清并用PBS洗两次，每孔加入100 μl PBS,再加入D-Luciferin使其终浓度为150 μg/ml, 立即用活体成像系统检测，分析发光强度与细胞数之间的相关性。

1.2.6细胞生长曲线绘制

取表达荧光素酶的MCF-7-luc细胞和作为对照的MCF-7细胞，接种于24孔板，接种密度为2×104/孔。细胞接种后1～7 d，每天胰蛋白酶消化其中3孔细胞，用细胞计数仪测定细胞数。以细胞生长天数为横坐标，细胞数目为纵坐标，分别绘制两种细胞生长曲线。

1.2.7BLAB/c裸鼠皮下移植瘤模型的建立

BLAB/c nu/nu裸鼠，4～5周龄，体重(15±2)g，雌雄各3只。取对数生长期的MCF-7-luc克隆细胞，用PBS重悬为2.5×107/ml悬液，每只裸鼠左右背侧近腋部皮下接种100 μl ，共接种6只。接种后第5 d采用德国BERTHOLD公司的活体成像系统检测信号强度。以后每5 d观测一次，连续观测30 d。观测前每只裸鼠戊巴比妥钠麻醉(计量为：35 mg/kg 体重)，按150 mg/kg体重的量腹腔注射luciferin(in vivo grade),10 min后，进行活体成像观察皮下肿瘤的生长情况，定量分析各时间点的荧光值。绘制肿瘤皮下生长曲线。

1.2.8MCF-7-luc细胞裸鼠皮下移植瘤的病理形态学观察

MCF-7-luc细胞裸鼠皮下接种后25 d，脱颈处死小鼠，取肿瘤组织，制成石蜡切片，切片厚度为3 μm,经HE染色后观察细胞的病理形态学。

2　结果

2.1　稳定表达荧光素酶的MCF-7细胞系(MCF-7-luc)的鉴定结果

经G418浓度梯度筛选，确定MCF-7细胞的最佳G418筛选浓度为800 μg/ml，pRc/CMV2-luc质粒转染MCF-7后经800 μg/ml的G418筛选2周后出现单一抗性克隆，挑选48个单克隆至96孔板后继续扩大培养并传代，至第5代时利用荧光素酶活性检测，共筛选出11个RLU值较高的抗性克隆(图1)。通过荧光素酶活性检测进一步逐步淘汰，最后传至30代时得到RLU最高的3个克隆clone26、clone27、 clone29作为阳性克隆，RLU值依次为：3.4×105、2.7×105、1.3×105，如图2所示。

图1　MCF-7-luc的荧光素酶鉴定

2.2　体外培养各浓度梯度MCF-7-luc活细胞的荧光值检测结果

采用倍比稀释法测定9个浓度梯度细胞的荧光值。活体成像系统nightOWL indigo软件进行图像采集和数据分析，结果显示体外活体细胞检测最少细胞数为156个，而且随着细胞的增加，光子数和细胞数量呈正相关，相关系数R2=0.986(图3)。

2.3　稳定表达荧光素酶的MCF-7细胞系的生长特性

细胞计数观察MCF-7细胞和表达荧光素酶的MCF-7-luc细胞的生长情况。MCF-7-luc clone26、MCF-7-luc clone27和MCF-7有相似的生长趋势(图4)。可见，稳定表达Luciferase的细胞株在构建过程没有对MCF-7 细胞的生长特性产生较大影响。

2.4　裸鼠皮下移植瘤模型的建立

MCF-7-luc clone26 细胞对BLAB/c裸鼠左右背侧近腋部皮下接种后第5 d通过活体成像系统能检测到肿瘤细胞的生物发光信号，随着时间的延长，荧光信号逐渐增强。在接种后第20 d荧光信号达到最强(光子数=6.4×106)(图5)，随荧光信号逐渐减弱，此时裸鼠开始消瘦，肤色变暗，出现晚期癌症患者的恶质化现象。随后处死裸鼠并解剖。综上所述，MCF-7-luc细胞能成功构建裸鼠皮下成瘤移植瘤模型，该模型能更灵敏、更直观地反映肿瘤在动物体内的生长情况。

图5　活体成像检测皮下接种的MCF-7-luc在裸鼠体内的生长情况

2.5　移植瘤病理形态改变

MCF-7-luc细胞移植瘤镜下癌细胞排列巢状、团索状，癌细胞大小形态各异，胞浆丰富，细胞核大深染，核分裂象多见，肿瘤中央可见局灶坏死。与MCF-7细胞对照组没有差别，都符合乳腺癌组织细胞特征(图6)。

图6　皮下接种MCF-7-luc模型的乳腺癌组织学结构，示癌细胞形态(HE 400×)

3　讨论

活体动物成像技术是近期发展起来的一种新型影像检测技术，是检测动物体内分子及细胞事件的强有力手段。利用生物发光成像(BLI)可以对活体病灶的大小进行无损伤直观准确检测[9]，具有极高的检测灵敏度及低廉的实验费用。来源于萤火虫的荧光素酶基因被人工分离并克隆到载体上，转染细胞后表达的荧光素酶在ATP、氧及底物Luciferin存在时，荧光素酶催化Luciferin的氧化反应可以产生发光现象。生物发光优点在于安全、实时、准确，为研究肿瘤的发生、发展过程和抗肿瘤药效动物实验提供了科学准确的依据[10]。因此被广泛用于肿瘤转移，基因治疗，干细胞示踪等相关研究[11]。

荧光素酶基因作为体内报告源的生物发光标记，具有灵敏、高效、易于检测等特性。研究中标记肿瘤细胞的体外生物发光结果显示细胞的发光强度与细胞的数目呈显著线性关系，为判断肿瘤的大小提供了直观的量化数据。而要将这种标记用于活体动物成像，首先要获得在非选择条件下长期、稳定表达荧光素酶的细胞系。本研究利用lipofectam ine2000，将携带荧光素酶基因的质粒转染到人乳腺癌细胞株MCF-7中，获得了具有稳定高表达luciferase的阳性克隆，并且证实了荧光素酶基因在MCF-7细胞中稳定表达。

在体外实验中，我们首先鉴定了MCF-7-luc的细胞数量与发光强度具有显著相关性，相关系数R2=0.986，并且，其发光能力强，最低可检测到大约156个细胞。这种相关性的存在，为判断肿瘤的大小提供了直观的量化数据，从而为直接利用生物发光强度判断肿瘤的生长及药物反应等研究提供了前提[12]。

用标记荧光素酶基因的细胞株MCF-7-luc建立裸鼠皮下移植瘤模型。因荧光素酶基因在MCF-7细胞中表达稳定，故可以间接反映肿瘤在体内生长情况。在肉眼尚不能发现肿瘤的时候即可使用该方法观察、量化活体内肿瘤细胞的生长，这就使得在还未触及肿瘤的情况下即可开始对动物皮下移植瘤模型进行药物处理成为可能。利用活体动物成像技术可以连续示踪肿瘤细胞在体内的生长情况，可以对同一研究个体进行长时间跟踪成像，避免靠不同时间宰杀动物获取实验数据，降低了实验成本以及动物组间人为操作误差。为研究肿瘤发生、发展分子机制和药物治疗的选择提供了新的工具。

本研究建立了稳定整合luciferase的人乳腺癌MCF-7-luc细胞系，并建立了以该细胞系为基础的乳腺癌裸鼠移植瘤模型，为利用活体成像技术探讨乳腺癌的生长转移机制及进行抗癌药物的研发提供了稳定可靠、直观、方便、灵敏的动物模型。