益气解毒方对TgN(p53mt-LMP1)/HT小鼠鼻咽黏膜上皮细胞周期相关蛋白的影响

吴新正，田道法，戴娜，何迎春，刘刚，刘湘



益气解毒方对TgN(p53mt-LMP1)/HT小鼠鼻咽黏膜上皮细胞周期相关蛋白的影响

吴新正，田道法，戴娜，何迎春，刘刚，刘湘

410006 长沙，湖南省第二人民医院耳鼻喉-头颈外科（吴新正、刘刚）；410208 长沙，湖南中医药大学中西医结合学院（田道法、何迎春、刘湘），第二中医临床学院 2008 级（戴娜），干细胞中药调控与应用实验室（何迎春）；421001 湖南衡阳，南华大学医学院（何迎春）

研究益气解毒方对 TgN(p53mt-LMP1)/HT 转基因小鼠鼻咽黏膜上皮细胞周期相关蛋白 p53、p21、CDK2和 cyclinD1的影响。

TgN(p53mt-LMP1)/HT 转基因小鼠随机分为 3 组，分别为模型组（MG）、益气解毒方干预组（YG）、维甲酸阳性对照组（TG），每组 24 只；同品系 C57BL/6J 鼠 24 只作对照组（CG）。各组均用诱癌剂二亚硝基哌嗪进行处理（每次剂量73 mg/kg，每周 2 次，共 28 次）。采用免疫组织化学染色法检测小鼠鼻咽黏膜上皮细胞周期相关蛋白 p53、p21、CDK2和 cyclinD1的表达水平，并采用 Western blot 法进行验证。

YG 组、TG 组及CG 组 p53 蛋白和 cyclinD1蛋白表达均显著低于 MG 组（<0.05）；YG、TG 及CG 组 p21 蛋白表达量高于 MG 组，差异有统计学意义（<0.05）；各组 CDK2蛋白表达量差异无统计学意义。

益气解毒方逆转鼻咽黏膜癌前病变的发展可能与下调 cyclin D1蛋白和上调 p21 蛋白表达有关。

鼻咽肿瘤； 癌前状态； 细胞周期蛋白类； 益气解毒方

鼻咽癌（nasoapharyngeal carcinoma，NPC）的发生一般需要经历癌前病变阶段，NPC（包括其癌前病变）的早期诊断和早期治疗为本病二级预防的主要内容。深入研究中医药在鼻咽癌前病变防治中的作用及相关机制，并由此促进其在 NPC 一级预防中的应用研究，具有重要意义。本课题组前期实验已证实 TgN(p53mt-LMP1)/HT 小鼠鼻咽/鼻腔黏膜上皮细胞过度增殖，并发展为癌前病变[1-2]。在此实验基础上，我们进一步以二亚硝基哌嗪（DNP）对TgN(p53mt-LMP1)/HT 小鼠进行化学诱导，以促进病变发展进程，并以益气解毒方干预，通过检测鼻咽黏膜上皮细胞周期相关蛋白p53、p21、CDK2和 cyclinD1表达水平，探讨益气解毒方逆转鼻咽癌前病变的作用机制，为益气解毒方在鼻咽癌前病变防治中的进一步应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 G8代5 月龄TgN(p53mt- LMP1)/HT 转基因阳性小鼠（中科动管会第 001号）为本课题组繁殖[1-2]，同品系同龄C57BL/6J 小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所，雌雄各半。

1.1.2 主要试剂与药品 SP-9001 兔 SP 检测试剂盒（511783A）、SP-9002 小鼠 SP 检测试盒（465909A）、鼠抗P21（A1209）、鼠抗 cyclinD1（A2709）、兔抗 P53（C1609）均为北京中杉生物技术有限公司产品；羊抗鼠IgG(H + L)、羊抗兔 IgG(H + L)、兔抗CDK2均为武汉博士德生物工程公司产品；维甲酸片剂（10 mg/片，批号：08054）购自山东良福制药有限公司；益气解毒方（由黄芪、黄连、党参、天花粉、茯苓、白花蛇舌草和甘草组成）中药饮片购自湖南中医药大学第一附属医院；二亚硝基哌嗪为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 药品制备 益气解毒方浓缩煎液的制备参照文献[3-4]所述方法进行，浓缩成含生药1240 g/L 的溶液，抽滤除菌，4 ℃保存备用；二亚硝基哌嗪以DMSO 完全溶解后，以生理盐水配成10% DNP 溶液，分装，4 ℃保存备用。维甲酸配制：每片药以生理盐水溶解，配成终浓度 1.8 g/L备用。

1.2.2 动物分组及处理 转基因阳性鼠 72 只，随机分为模型组（modeling group，MG）、中药益气解毒方组（Yiqi Jiedu formular group，YG）、维甲酸组（tretinoin positive controlling group，TG），每组 24 只；同品系健康 C57BL/6J 鼠 24 只作为对照组（control group，CG）。各组动物每次皮下注射 DNP 73 mg/kg，每周 2 次，共 28 次。同时，YG 组动物以益气解毒方浓缩煎液灌胃，TG 组动物予以维甲酸灌胃，给药量按“人与动物及各类动物间药物剂量的换算方法”计算，益气解毒方浓缩煎液每天灌胃量为12.91 g/kg，维甲酸每天灌胃量为 4.5 mg/kg；MG 组和 CG 组动物每天灌胃等体积蒸馏水 10 ml/kg；各组每天灌胃 1 次，共处理 14 周。

1.2.3 标本制备及处理 取材和标本制作参照何迎春等[3-4]所述方法。

1.2.4 p53、p21、CDK2、cyclinD1蛋白表达水平检测 采用 SP 法，严格按照试剂盒说明书进行。以 PBS 置换抗体作为阴性对照，已知的阳性病理组织作为阳性对照。按照参考文献[5]进行定量分析，结果以光密度值表示，光密度值越高蛋白表达水平越高。

1.2.5 蛋白质的印迹分析（Western blot） 分别提取各组小鼠鼻咽和鼻腔黏膜蛋白质，参照文献[6]进行分析。以 β-actin 作为内参照，结果采用目的蛋白与 β-actin 光密度值的比值表示蛋白的相对表达水平。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 实验小鼠一般情况

应用 DNP 诱导鼻咽癌前病变的实验中，每次完成 DNP 注射后，各组小鼠均出现精神萎靡、眯眼及食欲减退等现象，但于实验后期上述现象有所改善。在干预实验结束后，各组小鼠均见瘦弱，但 YG 组小鼠精神状况明显好于其他各组，较为活跃，皮毛较为光泽，无脱毛等现象。MG 组及 CG组小鼠仍表现精神萎靡，食欲减退，皮毛较为干枯，无光泽，呈现杂色变化，部分皮毛呈灰白色，脱毛较多；CG 组小鼠皮毛部分脱落，出现多例皮肤糜烂，皮毛色泽污秽。

2.2 鼻咽黏膜上皮细胞周期相关蛋白表达水平

2.2.1 鼻咽黏膜上皮细胞周期相关蛋白表达水平（SP 法检测） 各组鼻咽黏膜上皮均可检测到细胞周期相关蛋白 p53、p21、CDK2、cyclinD1的表达。TG 组 p53 蛋白表达量显著高于 MG 组、YG 组和 CG 组（< 0.05）；YG、TG 组 p21 蛋白表达量明显高于 MG 组（< 0.05）；TG、YG 和 CG 组 cyclinD1蛋白表达量显著低于 MG 组（< 0.05），而各组之间 CDK2表达量差异没有统计学意义，见表 1 和图 1 ~ 4。

2.2.2 鼻咽黏膜上皮细胞周期相关蛋白表达水平Western blot 法验证 各组小鼠鼻咽黏膜上皮 p53 蛋白表达量均较低，CG 组鼠也可检测到少量 p53 蛋白表达，YG、TG 及 CG 组 p53 蛋白、cyclinD1蛋白表达均显著低于 MG 组（< 0.05）；YG、TG 及 CG 组 p21 蛋白表达量高于 MG 组，差异有统计学意义（< 0.05）；各组 CDK2蛋白表达量差异无统计学意义，与免疫组织化学染色法结果基本一致，见图 5。

表 1 各组小鼠鼻咽黏膜上皮细胞周期相关蛋白表达水平比较（，n= 8）

注：与MG 组比较，*< 0.05，**< 0.01。

Note: Compared with MG group,*< 0.05,**< 0.01.

A：MG 组；B：TG 组；C：CG 组；D：YG 组

Figure 1 p53 protein expressions in epithelium of nasopharyngeal mucosa of these groups (SP, 400 ×)

A：MG 组；B：TG 组；C：CG 组；D：YG 组

Figure 2 p21 protein expressions in epithelium of nasopharyngeal mucosa of these groups (SP, 400 ×)

A：MG 组；B：TG 组；C：CG 组；D：YG 组

Figure 3 CDK2protein expressions in epithelium of nasopharyngeal mucosa of these groups (SP, 400 ×)

A：MG 组；B：TG 组；C：CG 组；D：YG 组

Figure 4 CyclinD1protein expressions in epithelium of nasopharyngeal mucosa of these groups (SP, 400 ×)

3 讨论

鼻咽癌前病变与鼻咽癌的内在病理关系，特别是其向癌变进展或向正常逆转的临界病理变化意义，已得到许多临床与实验结果的证实。鼻咽癌前病变的防治已成为鼻咽癌防治体系的重要一环，有效的鼻咽癌前病变防治，将有助于降低鼻咽癌发病率。在鼻咽癌前病变的防治链中，致癌物质与促癌物质对宿主鼻咽上皮细胞肿瘤遗传易感性的激活诱导效应的阻断，是构成鼻咽癌前病变有效防治的基础。而致癌物质与促癌物质诱发鼻咽癌前病变的机制、癌前病变进一步发展为鼻咽癌的具体过程，以及这一过程中癌基因与抑癌基因相互作用机制乃至相应的蛋白表达对鼻咽癌前病变及其向癌变发展过程的影响，有哪些因子发挥关键作用、各相关因子如何调节、促进这一病变过程并最终致癌变等问题，目前均不明确。

图 5 Western blot 法检测鼻咽黏膜上皮细胞周期相关蛋白表达水平

Figure 5 Cyclins expression in epithelium of nasopharyngeal mucosa of these groups tested by Western blot

本研究所用TgN(p53mt-LMP1)/HT 转基因小鼠（以下简称Tg 转基因小鼠）含外源突变型 p53 基因和 EB 病毒 LMP1 基因，在其生长发育中会表现癌前病变特征[1-2]。如施以 DNP 这一“外毒”因素进一步诱导该类病变，应可加快该类转基因小鼠靶器官癌前病变乃至癌变发生的速率。野生型p53 为肿瘤抑制蛋白（也称为 p53 蛋白或 p53 肿瘤蛋白），能调节细胞周期和避免细胞癌变发生。在鼻咽癌标本中，p53 在鼻咽癌组织中的阳性表达率明显高于鼻咽慢性黏膜炎组，p53 基因的过表达与癌细胞增殖活性成正相关，说明鼻咽癌中的 p53 为突变型[7]。p21 最初是作为 p53 的下游基因被发现的，是一种重要的细胞周期调控蛋白。它参与细胞的生长、分化、衰老及死亡过程，同时又与肿瘤发生密切相关，在细胞的生理、病理过程中发挥着重要的作用。彭维晖等[8]研究发现鼻咽癌的发生与 p21 相关，鼻咽癌组中 p21 的表达显著高于炎症组。p21 能够与 cyclin D/cdk 形成复合物使细胞周期停滞在 G1期；它还可以通过 C 端与 PCNA 相互作用，阻断 PCNA 活化 DNA 聚合酶的活性从而抑制 DNA 的合成，使细胞周期停滞[9]。G1期的 CDK 主要为 CDK2、CDK4和 CDK6，这三种 CDK 均可与 D 型蛋白形成复合体，而 E 型蛋白只与CDK2形成复合体。CDK2为细胞分裂所需的关键分子。

Wang 等[10]研究人员利用核磁共振分光技术结合生物化学与细胞分析方法，证实 p21 蛋白的螺旋亚结构域 LH 可发生结构变化，LH 的结构可变性确保了在与 Cdk-cyclin 复合物结合时，p21 的另外两个亚结构域 D1 和 D2 能够分别特异性结合在 cyclin 和 Cdk 亚基保守区域。

由于野生型 p53 蛋白极不稳定，半衰期很短，因此本研究中检测的是突变型 p53 蛋白和野生型 p53 蛋白的总量。维甲酸组 p53 蛋白显著增高，可能是促进了野生型 p53 蛋白的表达，而中药组与模型组无显著差异，该药是因为促进野生型 p53 蛋白表达的同时降低了突变型 p53 蛋白的量，还是对 p53 蛋白表达无影响，使得 p53 蛋白总量无明显变化，对于这点尚无定论。用药组鼻咽黏膜上皮细胞p21 蛋白表达均高于 MG 组（< 0.05）、cyclinD1蛋白表达均低于 MG 组（< 0.05 或< 0.01），而各组 CDK2蛋白表达水平无统计学差异。结果提示益气解毒方可能通过上调 p21 蛋白表达和下调 cyclinD1蛋白表达，使细胞周期停滞在 G1期，抑制细胞增殖，进而抑制转基因小鼠鼻咽黏膜癌前病变。YG 组 p21 蛋白表达高于 TG 组，说明益气解毒方上调 p21 蛋白表达作用可能强于维甲酸，并且 YG 组的小鼠生活状态要优于 TG 组，提示中药益气解毒方对动物的毒副作用小于维甲酸。

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The intervening effect of Yiqi jiedu formula on cell cycle proteins of nasopharyngeal epithelia in TgN(p53mt-LMP1)/HT mice

WU Xin-zheng, TIAN Dao-fa, DAI Na, HE Ying-chun, LIU Gang, LIU Xiang

Department of ENT/Head and Neck Surgery, the Second People's Hospital of Hunan Province, Changsha 410006, China (WU Xin-zheng, LIU Gang); School of Integrated Chinese and Western Medicine (TIAN Dao-fa, HE Ying-chun, LIU Xiang), Second Chinese Medicine Clinical Institute (DAI Na), Division of Stem Cell Regulation and Application (HE Ying-chun), Hunan Traditional Chinese Medicine University, Changsha 410208, China; Medical College of Nanhua University, Hengyang 421001, China (HE Ying-chun)

To investigate the effects of Yiqi Jiedu formula decoction on the expression of cell cycle protein such as p53, p21, CDK2and cyclinD1in nasopharynx of TgN(p53mt-LMP1)/HT mice.

72 transgenic mice of TgN(p53mt-LMP1)/HT were randomly divided into 3 groups as follows: modeling group (MG), treating group infused with Yiqi Jiedu decoction (YG) and positive controlling group infused with tretinoin (TG), with 24 animals in each group. 24 C57BL/6J mice were taken as the control group (CG). For all these animals, N,N-dinitrosopiperazine was given in a dose of 73 mg/kg each time by subcutaneous injection, two times per week and lasted for 14 weeks, with a total injection number of 28 times. The expression levels of p53, p21, CDK2and cyclinD1were tested by imunohistochemistry staining and verified by Western blot, respectively.

The expression levels of protein p53 and cyclinD1in YG, TG and CG groups were significantly lower than those in MG group (< 0.05), while the p21 expression levels were significantly higher than that in MG group (< 0.05). As for CDK2protein expression levels, there were no significant differences in these groups.

Yiqi Jiedu formula decoction exerts the reverse effects on the development of precancerous lesions in nasopharynx of TgN(p53mt-LMP1)/HT mice by down-regulating the expression level of cyclinD1and up-regulating the expression level of p21.

Nasopharyngeal neoplasms; Precancerous conditions; Cyclins; Yiqi Jiedu formula

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.02.007

HE Ying-chun, Email: yingchunhe@yahoo.com.cn

国家自然科学基金（81273988、81072904、30973856）；中国博士后科学基金（2011M501277）；湖南省科技计划项目（2010SK3021）；湖南省外国专家局“千人计划引智配套项目”（湘财社指[2011] 40 号和湘教通[2012] 488 号）；湖南省中医五官科学重点学科建设项目

何迎春，Email：yingchunhe@yahoo.com.cn

2012-10-08