Box-Behnken法优化发芽糙米富集γ-氨基丁酸条件研究

韩涛，陈野，纪绪前，郑晓晨，宋佳，刘环

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

γ-氨基丁酸（amino butyric acid，GABA）是一种非蛋白质氨基酸，广泛存在于动植物体中，由L-谷氨酸经谷氨酸脱羧酶催化转化而来，是一种重要的的抑制性神经递质[1]。GABA 具有降低血脂、防止肥胖及活化肝、活化肾功能以及改善脂质代谢等功能[2-3]。此外，GABA 还有促进乙醇代谢、促进生长激素分泌的功效[4]，并且对老年痴呆症（Alzheimer's disease）也具有良好的防治效果[5]。

近年来，糙米及发芽糙米中的GABA 成为了许多研究的焦点。有研究发现，糙米经过发芽处理，GABA含量大幅提高[6]；糙米的发芽过程可以提高谷氨酸脱羧酶活性，抑制丙酮酸转氨酶和GABA 氨酶活性，从而降低GABA 分解，使GABA 得到积累[7]。随着日本发芽糙米产品的出现，台湾地区也开发出了发芽保健米，国内学者就发芽糙米的功能性和生产技术也进行了研究[8-12]。到目前为止，国内尚无完整的富集发芽糙米中GABA 的生产技术的报道。本研究通过控制糙米发芽的相关技术参数，得到富含γ-氨基丁酸的发芽糙米，提高其营养价值和生理功能特性，为糙米和发芽糙米的深加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

宁河1 号（粳稻）：天津市津源海米业有限公司；γ-氨基丁酸（GABA）标品（纯度＞99%）：SIGMA 公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）：天津市康科德科技有限公司；邻苯二甲醛（OPA 化学纯）：天津市光复精细化工研究所；β-巯基乙醇（纯度＞99%）：AMERCO 公司。

1.2 仪器与设备

HPX-250B 型恒温恒湿培养箱：上海悦丰仪器有限公司；TDL-5-A 型低速台式大容量离心机：上海安亭科学仪器厂；Agilent-1200 型高效液相色谱仪（附紫外检测器）、TC-C18 反相色谱柱（4.6 mm×250 mm 5 μm）：AGILENT 公司；0.45 μm 微孔滤膜（有机系）。

1.3 方法

1.3.1 糙米发芽工艺

挑选颗粒饱满、成熟度高的糙米，蒸馏水清洗3遍，以质量分数0.5%的次氯酸钠溶液进行浸泡消毒10 min，再用蒸馏水清洗3 遍。然后在不同条件下浸泡、发芽，最后在80 ℃热水中浸泡10 min 进行灭酶处理，之后55 ℃烘箱干燥，使水分含量降至10%以下。

1.3.2 GABA 的测定

1.3.2.1 HPLC 色谱检测条件

Agilent TC-C18 反相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温40 ℃；流动相：1.6 g CH3COONa·3H2O（pH7.2），600 mL；甲醇200 mL；乙腈200 mL；衍生试剂[13]：称取400 mg OPA，以50 mL 甲醇溶解后加入β-巯基乙醇400 μL。（4 ℃保存）检测波长338 nm；进样量20 μL；流速1 mL/min。

1.3.2.2 样品GABA 的检测

分别将糙米和发芽糙米样品粉碎，过40 目标准筛，于双层密封袋中4 ℃保存。精确称取1.0 g 米粉样品，准确加入5 mL 质量分数为5%的三氯乙酸（TCA）溶液，振荡5 min，40 ℃水浴2 h，水浴后5 000 r/min 离心20 min，取上清液进行OPA 柱前衍生5 min，之后立即过膜，上机检测。

1.3.2.3 GABA 标准曲线的制作

准确称取125 mg GABA 标品，用超纯水溶解并定容至100 mL，得浓度为1 250 mg/L 标准溶液。再用上述标准溶液配成3.125、6.25、12.5、22.5、32.5、42.5 mg/L 系列浓度的标准溶液，以OPA 柱前衍生后进样检测，以峰面积为横坐标，标准液浓度为纵坐标制成标准曲线。

1.4 方法与设计

1.4.1 单因素试验

以浸泡温度、浸泡时间、发芽温度和发芽时间为试验考察因素，以GABA 含量为试验考察指标，做以下单因素试验：

浸泡温度：取7 份糙米，每份15 g，分别用50 mL蒸馏水在20、24、28、32、36、40、44 ℃条件下浸泡8 h，取出灭酶，干燥，测定每份样品的GABA 含量。

浸泡时间：在32 ℃条件下，将150 g 糙米用500 mL蒸馏水浸泡，分别在0、4、8、12、16、20、24、28、32、36 h取出，经灭酶，干燥后，测定样品GABA 含量。

发芽温度：用300 mL 蒸馏水将90 g 糙米在32 ℃条件下浸泡8 h，之后分为6 份，分别放入温度为20、24、28、32、36、40 ℃的培养箱中培养20 h 后，取出灭酶，干燥制样，得发芽糙米，测定其GABA 含量。

发芽时间：用600 mL 蒸馏水将180 g 糙米在32 ℃条件下浸泡8 h，之后分为12 份，放入温度为32 ℃的培养箱中进行发芽，分别在8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h 后取出，灭酶，干燥，得到12 份不同的发芽糙米，分别测定其GABA 含量。

1.4.2 优化试验

在单因素试验基础上，运用四因素三水平的Box-Behnken 响应面试验设计方法[14]，以浸泡温度、浸泡时间、发芽温度以及发芽时间为研究因素，以发芽糙米GABA 含量为指标。

1.5 数据分析

运用Design-Expert 软件（Version 8.0.6）对响应面试验所得数据进行线性回归和方差分析，模型和因素的显著性以F 值进行考察（P＜0.05），所有试验均重复3 次，以干基表示结果。

2 结果与分析

2.1 GABA 的高效液相色谱检测图

利用柱前衍生高效液相色谱法测定GABA 标准品和发芽糙米样品的谱图如图1。

由图1 可知，GABA 与其他氨基酸衍生物分离比较完全，其他杂质对测定基本没有干扰。

2.2 GABA 标准曲线

以峰面积（×105）为横坐标，GABA 标品浓度（mg/L）为纵坐标制作标准曲线并进行线性回归分析，标准曲线见图2。回归方程为Y=0.113 5X-0.459 2，R2=0.999 6。

图1 GABA 的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of standard GABA

图2 GABA 标准曲线Fig.2 Standard curve of GABA

Y 与X 显著相关，表明GABA 在该质量浓度范围内呈良好的线性。

2.2 单因素试验

2.2.1 浸泡温度对GABA 含量的影响

为了考察浸泡温度对GABA 含量的影响，以发芽糙米中的GABA 为指标，选取不同浸泡温度进行单因素试验，实验结果如图3。

图3 浸泡温度对GABA 含量的影响Fig.3 Effect of soaking temperature on GABA content in germinated brown rice

由图3 可知，20 ℃～32 ℃的区间内，GABA 含量随温度的升高而升高，于32 ℃时达到最大值127.64 mg/100 g；32 ℃～44 ℃范围内，GABA 含量随着温度的升高而降低。因此，最佳浸泡温度确定为32 ℃～36 ℃之间。另外，由于测得的未发芽糙米中GABA 的含量为85.78 mg/100g，因此可以看出，发芽处理可以明显提高糙米GABA 含量。

2.2.2 浸泡时间对GABA 含量的影响

为了考察浸泡时间对GABA 含量的影响，以发芽糙米中的GABA 为指标，选取不同浸泡时间进行单因素试验，实验结果如图4。

图4 浸泡时间对GABA 含量的影响Fig.4 Effect of soaking time on GABA content in germinated brown rice

由图4 可知，20 h 之前，发芽糙米中GABA 含量随浸泡时间的延长而逐渐增加；浸泡时间20 h 时有最大值100.97 mg/100 g。20 h 后，发芽糙米GABA 含量随时间的延长而逐渐减少。因此，确定浸泡时间20 h 左右为较佳浸泡时间。

2.2.3 发芽温度对GABA 含量的影响

为了考察发芽温度对GABA 含量的影响，以发芽糙米中的GABA 为指标，选取不同发芽温度进行单因素试验，实验结果如图5。

图5 发芽温度对GABA 含量的影响Fig.5 Effect of germination temperature on GABA content in germinated brown rice

由图5 可知，在32 ℃之前，GABA 含量随着温度的升高而逐渐增加，但温度超过32 ℃后，曲线呈平缓趋势。40 ℃以后迅速下降，因此，最佳发芽温度确定为32 ℃左右。

2.2.4 发芽时间对GABA 含量的影响

为了考察发芽时间对GABA 含量的影响，以发芽糙米中的GABA 为指标，选取不同发芽时间进行单因素试验，实验结果如图6。

图6 发芽时间对GABA 含量的影响Fig.6 Effect of germination time on GABA content in germinated brown rice

由图6 可知，GABA 含量在8 h～13 h 内随时间逐渐增加，在13 h～18 h 缓慢增长，在18 h～23 h 时增长迅速，23 h 时 达 到134.97 mg/100 g；28 h 达 到 峰 值135.79 mg/100 g，之后在28 h～43 h 内先降低后升高，并在38 h 时GABA 含量达到又一峰值，但未超过28 h 的峰值，因此，由GABA含量确定最佳发芽时间为23h～28 h。

2.3 响应面设计试验

根据单因素试验结果设定浸泡温度范围24 ℃～40 ℃，浸泡时间范围12 h～28 h，发芽温度范围28 ℃～40 ℃，发芽时间范围18 h～33 h，采用Box-Behnken 响应面设计法优化发芽条件[9]。试验因素水平和编码见表1 所示，试验安排及结果如表2，回归模型的方差分析见表3。

表1 Box-Behnken 响应面设计试验因素水平和编码Table 1 Variables and levels in response surface design

2.3.1 二次多项式回归模型

经分析得到的发芽条件与GABA 含量之间的二次多项式模型为：

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Process variables and levels in response surface central composite design and experimental results

由表3 可以看出，因素X1、X3、X2X4对发芽糙米GABA 含量影响极显著（P＜0.01），X2、X4、X2X3对萌芽豇豆中GABA 的含量影响显著（P＜0.05），X1X2、X1X3、X1X4、X3X4对萌芽豇豆中GABA 的含量影响不显著（P＞0.05）。

2.3.2 两因素间交互作用

响应面图及等高线图见图7～图12，各因素及其交互作用对响应值的影响结果可通过该组图直观反映出来。等高线的形状反映了交互作用的强弱，椭圆表示两两交互作用显著，圆形则表示交互作用不显著[15]。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

2.3.2.1 浸泡温度和浸泡时间的交互作用

由图7 可以看出，浸泡温度和浸泡时间的交互作用不显著，随浸泡温度和浸泡时间的增加，GABA 含量有缓慢增加后又降低，浸泡温度过高，浸泡时间过长都对发芽糙米GABA 富集不利。所以浸泡温度在33 ℃左右，浸泡时间在20 h 左右，发芽糙米中GABA 的含量最高。

2.3.2.2 浸泡温度和发芽温度的交互作用

由图8 可以看出，浸泡温度和发芽温度的交互作用不显著，随浸泡温度和发芽温度增加，GABA 含量缓慢增加，但是浸泡温度和发芽温度过高，GABA 含量下降。所以浸泡温度在33 ℃左右，发芽温度34 ℃左右，GABA 含量最高。

2.3.2.3 浸泡温度和发芽时间的交互作用

由图9 可知，浸泡温度和发芽时间的交互作用不显著，随着浸泡温度和发芽时间的增加，GABA 含量缓慢增加后又缓慢降低。浸泡温度在33 ℃左右，发芽时间在27 h 左右，GABA 含量达到最高。

图7 浸泡温度（X1）与浸泡时间（X2）响应面图和等高线图Fig.7 Response surface and contour plot showing the interactive effects of soaking temperature and time on GABA content in germinated brown rice

2.3.2.4 浸泡时间和发芽温度的交互作用

从图10 可知，浸泡时间和发芽温度的交互作用显著。随着浸泡时间和发芽温度的增加，GABA 含量增加，但超过一定范围后GABA 含量下降，变化较为明显。浸泡时间在20 h 左右，发芽温度在34 ℃左右，GABA 含量最高。

2.3.2.5 浸泡时间和发芽时间的交互作用

由图11 可知，浸泡时间和发芽时间的交互作用达极显著水平，面形变化明显，随着浸泡时间和发芽时间的增加，GABA 含量增加。但浸泡时间和发芽时间过长都不利于GABA 积累。浸泡时间在20 h 左右，发芽时间在27 h 左右，有最高GAB A 含量。

2.3.2.6 发芽温度和发芽时间的交互作用

由图12 可知，发芽温度和发芽时间的交互作用不显著，随着发芽温度和发芽时间的增加，GABA 含量缓慢增加后又缓慢降低。发芽温度在34 ℃左右，发芽时间在27 h 左右，GABA 的含量最高。

图8 浸泡温度（X1）与发芽温度（X3）响应面图和等高线图Fig.8 Response surface and contour plot showing the interactive effects of soaking temperature and germination temperature on GABA content in germinated brown rice

图9 浸泡温度（X1）与发芽时间（X4）响应面图和等高线图Fig.9 Response surface and contour plot showing the interactive effects of soaking temperature and germination time on GABA content in germinated brown rice

图11 浸泡时间（X2）与发芽时间（X4）响应面图和等高线图Fig.11 Response surface and contour plot showing the interactive effects of soaking time and germination temperature on GABA content in germinated brown rice

图12 发芽温度（X3）与发芽时间（X4）响应面图和等高线图Fig.12 Response surface and contour plot showing the interactive effects of germination time and temperature on GABA content in germinated brown rice

2.3.3 模型的优化与验证

通过优化分析得到最佳的发芽条件为浸泡温度34.23 ℃、浸泡时间21.73 h、发芽温度33.44 ℃、发芽时间26.53 h，发芽糙米中GABA 含量预测值为188.76 mg/100 g，依据实际情况，选择浸泡温度34 ℃、浸泡时间21 h、发芽温度33 ℃和发芽时间26 h 进行验证试验，得到GABA 的含量为189.58 mg/100 g，与预测值接近。

3 结论

通过响应面法建立了浸泡温度、浸泡时间、发芽温度以及发芽时间四因素的回归模型：

依据回归方程与实际情况得最优的工艺参数为浸泡温度34 ℃、浸泡时间21 h、发芽温度33 ℃、发芽时间26 h，GABA 的含量达189.58 mg/100 g，与预测值接近，说明了建立的回归模型能够很好的预测糙米发芽条件与GABA 含量之间的关系。同时说明了响应面法优化发芽糙米富集GABA 参数的可行性。

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