番石榴叶提取物-槲皮素的抑菌效果

柯昌松，王轰，牟伟丽

（蓬莱京鲁渔业有限公司，山东 蓬莱 265609）

槲皮素是番石榴叶提取物，属于黄酮类化合物。黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、抗菌等广泛的生理活性，番石榴叶提取物-槲皮素通过拮抗钙离子通道，使病毒因缺少钙离子的辅助而不能进入细胞，从而增强机体免疫力，达到抗病毒的目的[1-3]。现在，食品腐败是食品界非常关注的问题。微生物的侵袭是食品腐败的主要因素之一，我国每年由于微生物侵袭损失大量粮食。因而在生产加工和储藏的过程中，防腐剂的使用就显得尤为重要。但是由于合成的食品添加剂往往有一定的毒副作用，现在人们越来越倾向于选择天然物质作为食品防腐剂，因而高效的天然食品防腐剂成为食品工业的研究热点。黄酮类化合物如槲皮素具有抗菌、抗炎、抗氧化特性，在浓度为2.5%时可抑制葡萄球菌和枯草杆菌的生长，可用作食品防腐保鲜剂[4]。根据黄酮类物质具有较强抑菌活性的特点，本试验以灭菌生理盐水为对照，研究了番石榴叶提取物-槲皮素黄酮类物质对常见致病细菌的抑制作用，通过滤纸圆片法测抑菌圈的定性实验和不同浓度番石榴叶提取物液测最低抑菌浓度，初步了解番石榴叶提取物-槲皮素的抑菌情况，为进一步探寻其作为“绿色”防腐剂的提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 培养基及试剂

营养琼脂、肉汤培养基、灭菌生理盐水（0.85%）。

1.1.2 菌种

1.1.3 仪器

灭菌锅、超净工作台、培养箱、培养皿、酒精灯、镊子、接种环、移液枪、打孔机、滤纸片（注：滤纸圆片直径为2 mm，厚度为1.5 mm 的新华滤纸）。

1.2 实验方法

1.2.1 番石榴叶提取物-槲皮素的制备

将番石榴叶鲜叶洗净、晒干，放入烘箱烘烤后粉碎，用石油醚浸泡脱脂3 次，每次24 h，脱脂后的叶子加水约20 倍，煮沸提取二次，在搅拌下缓慢加入石灰水至pH 为8～9，然后加入3%的硼酸，在此pH 条件下煮20 min～30 min；趁热过滤，残渣反复过滤3 次，在60 ℃～70 ℃条件下，用浓盐酸将pH 调为5，酸水液放置24 h，抽滤；用水将沉淀物洗至中性，70 ℃～80 ℃干燥后，然后95%乙醇重结晶，用甲醇做洗脱剂，将提取物的溶液烘干制成干粉，得到槲皮素黄绿色纯品（＞90 %）。实验时以50%乙醇稀释成不同的浓度。将提取物称取1.000 0 g 加入10 mL 50%乙醇溶液加塞置4 ℃冰箱浸泡过夜，取出再置80 ℃水浴热浸4 h，缩成1 g/mL的番石榴叶提取物，置冰箱备用。

1.2.2 菌株的制备

将菌种移接入相对应的试管斜面培养基上，重复接种，记录接种名称和日期。细菌置35 ℃～37 ℃恒温培养箱内培养18 h～24 h，每种菌株取2 支供测试用，其余注明日期。置于0 ℃～4 ℃，冷藏备用。

1.2.3 番石榴叶提取物储存液制备

番石榴叶提取物储存液制备，见表1。

以AES算法为例，在设计加解密算法硬件模块时以分组算法为基础。将明文按一定长度分组，明文组经过加密运算得到密文组，密文组经过解密运算（加密运算的逆运算）还原成明文组。分组算法分组可使用128、192或256位甚至更高位的密钥，可对应10、12等轮数[13]。分组算法的示意图如图9所示。

表1 番石榴叶提取物的称量Table 1 The weight of Guava leaf extract

1.2.4 培养基的制备和制备平板

将配置好的培养基，经高压灭菌后，冷却至45 ℃，倾注于干热灭菌培养皿内，每皿15 mg～20 mg。先加1 mL 菌液于营养琼脂中，让菌液与营养琼脂充分摇匀，记录菌株名称、浓度和日期。

1.2.5 抑菌圈的测定（滤纸圆片法）[5]

番石榴叶提取物进行滤纸圆片实验前，先做定性实验，取经高压灭菌后置55 ℃～60 ℃烘箱内烘2 h 的滤纸片，分别置于浓度为1 g/mL 槲皮素水溶液中浸泡10 min，用镊子镊取滤纸圆片，在瓶壁上沥去多余的溶液，放入菌液平板上。记录下菌编号、药片的浓度编号和日期，细菌平板倒置35 ℃～37 ℃培养18 h～24 h，观察有无抑菌作用。

将番石榴叶提取液（相当原液1 g/mL 的量）逐步降低浓度，将番石榴叶提取液和等量的双倍浓度的营养肉汤相混合，稀释成浓度为500、250、125、62.5 mg/mL。取经高压灭菌后置55 ℃～60 ℃烘箱内烘2 h 的滤纸片，分别置于番石榴叶提取物溶液中浸泡10 min，用镊子镊取滤纸圆片，在瓶壁上沥去多余的溶液，放入菌液平板上。每种菌涂布3 个平板，每个平板中十字对称放处理过的4 张滤纸圆片。记录下菌编号、滤纸片的浓度编号和日期，细菌平板倒置35 ℃～37 ℃培养18 h～24 h；观察它的抑菌圈直径，取3 只培养皿连续平行测试3 次，记录平均值。

1.2.6 最低抑菌浓度的测定

采用平板划线法[6-7]测定大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的最低抑制浓度，在培养基上划线培养细菌，以有无菌生长为判断标准，与对照组（菌落生长正常）比较，有肉眼可见菌落者为无抑菌作用；无菌落生长的番石榴叶提取物浓度为番石榴叶提取物的最低抑菌浓度（MIC）。把待测物用乙醇溶解稀释成500、250、125、62.5 mg/mL，吸取各种浓度溶液1 mL，分别加入直径8 mm 的培养皿中，每皿加入已融化的培养基9 mL，摇匀，静置待凝后制成含有待测浓度供试样品的平板。在培养皿上划线接种，细菌平板倒置35℃～37 ℃培养18 h～24 h 培养菌落，观察个培养皿是否长菌及菌落生长情况。每种番石榴叶提取物浓度梯度做一组平行试验，以完全没有菌生长的最低浓度为番石榴叶提取物的MIC 值。

表2 番石榴叶提取物的抑菌作用定性实验结果Table 2 Qualitative experimental result for inhibitory effect of Guava leaf extract

2 结果与分析

番石榴叶提取物的抑菌作用定性实验结果，见表2。

由表2 影像结果可以看出番石榴叶提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌都有抑菌效果。

表3 番石榴叶提取物抑菌作用结果Table 3 The result for inhibitory effect of Guava leaf extract

由表3 结果可知，番石榴叶子中的提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的抑制作用很明显，其中对大肠杆菌、沙门氏菌抑制最强，抑菌圈直径为13.5 mm、18.7 mm，对金黄色葡萄球菌的抑制作用较弱，抑菌圈直径为10.5 mm。

番石榴叶提取液最低抑菌浓度的测定结果，见表4。

从表4 可以看出：番石榴叶提取液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌都有明显的抑菌作用，当番石榴叶提取液浓度为1.25%时，大肠杆菌、沙门氏菌的生长完全被抑制，培养皿中无菌落生长，当番石榴叶提取液浓度为2.5%时，枯草芽孢杆菌、志贺氏菌的生长完全被抑制。该番石榴叶提取液的最低MIC 值为：大肠杆菌（MIC）1.25%，枯草芽孢杆菌（MIC）2.5%，金黄色葡萄球菌（MIC）5%，沙门氏菌（MIC）1.25%，志贺氏菌（MIC）2.5%。

表4 番石榴叶提取液最低抑菌浓度的测定结果Table 4 Outcome measure for MIC of Guava leaf extract

3 结论与讨论

由定性测试结果显示，番石榴叶提取液各种浓度对供测试细菌如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的抑制作用明显。被抑制的细菌中既有革兰氏阳性菌，也有革兰氏阴性菌；既有球菌，也有杆菌；抑菌试验结果表明，番石榴叶提取液对常见致病菌和腐败菌具有明显的抑制作用。其中对沙门氏菌、大肠杆菌抑制效果最强，MIC=1.25%，抑菌圈直径为18.7 mm、13.5 mm。对金黄色葡萄球菌的抑制作用较弱，MIC=5%，抑菌圈直径为23.5 mm。番石榴叶提取液作为天然抗氧化、抗菌主要成分之一，其安全性能极高，如将其用在食品中进行防腐，其推广和应用必将带来巨大的经济和社会效益。

[1]陈新谦,金有豫,汤光.新编药物学[M].15 版.北京：人民卫生出版社,2006：252

[2]李多,邓述恺,陈思宇.抗菌药物[J].中国全科医学,2007,11(8)：656

[3]陈祝群,例槲皮素型超敏迟缓相反应的临床报告[J].中国医药导报,2006,17(3)：70

[4]谢宗万.全国中草药汇编(上册)[M].北京：人民卫生出版社,1996：882

[5]杨履渭,刘秉阳.微生物学及检验技术(细菌对药物敏感试验)[M].广州：广东科技出版社,1992：440-447

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：化学工业出版社,2005：附录Ⅵ

[7]United state Inc.The United states pharmacopeia USP 27.NF22[S].Rockville,MD：United state pharmacopeia,2004：216