rAAV2/1-Acrp30对实验性糖尿病对大鼠肝脏细胞形态学的影响

王 静钟惠菊周 军李 琼王适龙

（1 中南大学湘雅医院，湖南 长沙 410078；2 中南大学湘雅三医院，湖南 长沙 410013）

rAAV2/1-Acrp30对实验性糖尿病对大鼠肝脏细胞形态学的影响

王 静1钟惠菊1周 军2李 琼1王适龙1

（1 中南大学湘雅医院，湖南 长沙 410078；2 中南大学湘雅三医院，湖南 长沙 410013）

目的 观察rAAV2/1-Acrp30对实验性糖尿病对大鼠肝脏细胞形态学的影响。方法 以高脂高糖喂养4周加上35mg/kgSTZ腹腔注射建立大鼠糖尿病模型，将其随机分为糖尿病对照组组、脂联素治疗组、空病毒组，并设正常对照组。结果 模型组较正常对照组血糖、饮水量、体质量均明显升高（P＜0.01），血清APN显著下降（P＜0.01）；与糖尿病对照组及空病毒组相比，治疗组的饮水量、空腹血糖的情况是显著降低（P＜0.05），体质量上升（P＜0.05），血清TC、TG、LDL降低（P＜0.05），HDL明显升高（P＜0.05）；肝脏形态学表明肝细胞结构清晰且完整，肝细胞脂肪变性与炎症细胞浸润呈减少的特点；肝脏APN的表达呈上升特点（P＜0.01），肝脏NF-κBp65、IκBα与IL-1β明显降低（P＜0.05）。结论 rAAV2/1-Acrp30能够降低血糖与血脂，较好的改善糖尿病大鼠肝脏炎性细胞的浸润以及肝细胞脂肪变性。

实验性；糖尿病；大鼠肝脏细胞；NF-κBp65

脂联素（APN）具有增加胰岛素敏感性、抗炎、抗动脉粥样硬化以及抗糖尿病的功能，其循环浓度在胰岛素抵抗或2型糖尿病等患者中[1]都降低，而给予小鼠的体内注射重组脂联素就会使得模型鼠血糖降低同时优化胰岛素抵抗[2]。本研究观察rAAV2/1-Acrp30对实验性糖尿病对大鼠肝脏细胞形态学的影响。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备

8周龄雄性Wistar大鼠50只适应性喂养1周后随机分为两组，正常对照组（C）8只以普通饲料喂养，模型组（M）42只喂以高糖高脂饲料。4周后M组大鼠隔夜空腹腹腔注射STZ35mg/kg，C组仅注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72h后大鼠测随机血糖≥16.7mmol/L为糖尿病模型造模成功。

1.2 给药方式

将造模成功的27只大鼠随机分为糖尿病对照组、空病毒组以及脂联素治疗组，每组n=9。各组大鼠从造模成功次日开始给药rAAV2/1-Acrp30基因（滴度为1012 vector genomes/mL，vg/mL，由前期实验组构建[3]）。观察4周后处死。在这阶段，正常对照组进行普通饲料的喂养，其余3组则予以高糖高脂的饲料进行喂养。

1.3 生化指标检测

分别于4周、8周末断尾取血测血糖（BG），8周末隔夜空腹从心脏取血测定FBG，血清TG、TC、HDL、LDL、APN，之后将其处死。FBG用强生快速血糖仪进行测定；血清TG、TC等则用全自动的生化分析仪进行测定，血清脂联素采用酶联免疫法。

1.4 肝脏组织病毒组织学观察

取小块的肝组织4%多聚甲醛固定，用石蜡包埋，切片，Masson染色及Red-oil特殊染色，对病理情况进行观察[4]。

1.5 免疫组化染色和图像分析

免疫组化染色采用ABC法，DAB显色，并以PBS作空白对照。阳性结果是胞浆/胞核染成棕黄色。组织切片都通过NIS-Elements AR 3.0软件拍照来收集到全组织的切面图像。用双盲法来进行分析，在高倍镜下随机的确定10个视野，计同类细胞中阳性细胞所具有的个数，取样本的平均值进行组间的比较。

1.6 统计学处理

所有数据用SPSS17.0统计软件处理，组间比较，采用t检验和SNK-q检验或非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 rAAV2/1-acrp30对糖尿病大鼠一般情况影响

C组大鼠在整个实验过程中精神状态良好，活动灵活，毛色光洁，后期体质量增加。D组和V组大鼠精神状态萎靡，毛色晦暗、枯黄，进食量、尿量、饮水量增加，体质量减轻。A组大鼠精神状态可，活动灵活，毛色稍晦暗，进食量、尿量、饮水量较D组和V组有减少，后期体质量略有增加。

2.2 rAAV2/1-acrp30对糖尿病大鼠血糖、血脂和血清脂联素的影响

血清指标显示：rAAV2/1-Acrp30干预4周后，与D组和V组相比，A组血清FBG、TC、TG、LDL明显降低（P＜0.05），HDL明显升高（P＜0.05），血清APN无明显差异（P＞0.05）。

2.3 肝脏肉眼观察

模型组和空病毒组大鼠肝脏体积变大，外观是灰黄色，边缘呈圆钝，质地软，表现为典型肝脂肪变状态。脂联素组大鼠肝脏体积出现了增大，外观为红色偏黄，质地软，和糖尿病对照组与空病毒组比有显著的改善。

2.4 肝组织病理形态学变化

Masson染色显示：C组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞结构正常，分界清，核圆同时清晰，位于细胞中央，肝窦排列也规则。D组和V组大鼠肝细胞呈大小不等的空泡变性，部分胞核出现被挤压于细胞边缘的情况，肝索排列紊乱，大量的炎性细胞浸润。A组大鼠肝细胞索结构比较清楚，肝窦较为正常，出现少量炎性细胞浸润。在四组中，都没有发现蓝色纤维组织。箭头所指处表示炎性细胞浸润。

Red-oil染色显示：C组肝组织可见极少量脂肪滴。D组和V组可见大量大小不等的脂肪滴存在。A组肝细胞脂肪变性明显减轻，多以小脂滴状存在。

2.5 rAAV2/1-acrp30对糖尿病大鼠肝脏APN及NF-κBp65、IκBα、IL-1β免疫组化染色的影响结果见表1。

表1 各组大鼠APN、NF-κBp65、IκBα、IL-1β比较（）

表1 各组大鼠APN、NF-κBp65、IκBα、IL-1β比较（）

注：与C组比较AP＜0.01，aP＜0.05；与D组比较BP＜0.01，bP＜0.05；与V组比较CP＜0.01，cP＜0.05

组别鼠数APNNF-κBp65IκBαIL-1β C614.33±4.3212.5±3.390.33±0.520.50±0.55 D76.00±2.24A61.14±8.86A5.43±1.62A7.71±1.98AV75.43±2.82A55.29±6.10A5.14±1.95 A7.86±2.16AA717.86±4.02BC28.86±5.37ABC2.71±1.89abc5.14±1.35Abc

肝脏APN的表达提示：A组较D组和V组显著升高（P＜0.01），D组和V组较C组显著降低（P＜0.01）；肝脏NF-κBp65、IκBα、IL-1β的表达提示：A组较D组和V组明显降低（P＜0.05），D组和V组较C组明显增加（P＜0.01）。

3 讨 论

本研究结果表明，在糖尿病时，模型组肝脏中NF-κBp65、IκBα等的表达都较对照组是增加的，而在rAAV2/1-Acrp30治疗一定阶段后，细胞因子在治疗组较对照组与空病毒组是降低的，且差异性比较明星，可以推测：NF-κBp65、IκBα、IL-1β在糖尿病时在肝脏的表达明显升高，提示其参与了糖尿病的产生与发展，因而可通过抑制NF-κB、IκBα、IL-1β的活化，减少其产生，从而降低肝内炎症的反应。

综上所述，用腺相关病毒重组脂联素治疗可以降低血糖，优化脂质代谢紊乱，优化糖尿病大鼠肝脏炎性细胞的浸润与肝细胞的脂肪变性，减少IL-1β等炎症因子在肝脏的表达，降低炎症反应，更好的保护患者的肝脏，缓解糖尿病。

[1] Hotta K,Funahashi T,Arita Y,et al.Plasma concentrations of a novel,adipose specific protein,adiponectin,in type 2 diabetic patients[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20(6):1595-1599.

[2] Maeda N,Shimomura L,Kishida K,et al.Diet-induced insulin resistance in mice lacking adiponectin/ACRP30[J].Nature Med, 2002,8(7): 731-737.

[3] 李强翔,钟惠菊,盛杰,等.重组腺相关病毒介导的大鼠脂联素载体的构建与鉴定[J].现代生物医学进展,2008,8(3):430-433.

[4] 于淼,朴春红.从毒损肝络探讨胰岛素抵抗、2型糖尿病炎症发病机制[J].中华实用中西医杂志,2006,19(6):614-615.

R587.1；R-33

B

1671-8194（2013）36-0038-02