鹅细小病毒与番鸭细小病毒差异分析及鉴别诊断方法研究进展

鲜思美

(贵州大学动物科学学院，贵州省动物疫病研究所，贵州贵阳 550025)

小鹅瘟(Gosling plague，GP)是由鹅细小病毒(Goose Parvovirus，GPV)引起雏鹅的一种高致死性疾病，又称鹅细小病毒感染(Goose parvovirus infection，GPVI)或Derzsy’s 病。该病是以急性肠炎及肝、肾、心脏实质脏器败血性病变为特征的烈性传染病，传播迅速，以4～20日龄雏鹅消化道，尤以小肠部位的纤维素性、栓塞性病变为主要特征。该病病程短促，传染性强，传播快，死亡率高［1］。

番鸭细小病毒病是由番鸭细小病毒(Muscovy duck Parvovrius，MDPV)引起侵袭雏番鸭为主的一种急性传染病，临床上以喘气、腹泻及胰脏坏死和出血为主要特征［2］。鹅细小病毒病和番鸭细小病毒病是严重危害水禽饲养业的传染病，临床上常在同一地区流行，甚至混合感染。两种疫病的流行病学、临床症状、病理变化都非常相似;两种病毒的大小、形态、结构蛋白、理化特性、核酸类型和基因组结构等方面也非常相似，两者的血清也有一定的交叉保护性，用常规的血清学检测方法很难将这两种病毒区分，临床上鉴别诊断难度较大。我国是发现和研究鹅细小病毒病和番鸭细小病毒病最早的国家，于1988年在国内外首次明确了MDPV 不同于GPV，两者存在差异［3－4］。本文从病毒的基因组结构、病毒编码蛋白方面进行比较分析，概述两种病毒在基因组结构和抗原性上存在的差异及已建立的鉴别诊断方法。

1 病毒的基因组结构比较

GPV与MDPV 两者同属于细小病毒科细小病毒属，基因组为单股、线状DNA，正极性DNA 链的病毒粒子和含有负极性DNA 链的病毒粒子数目基本相等［5］。匈牙利学者Zadori［6］(1995)对GPV和MDPV 毒株进行了核苷酸序列测定，并与禽和哺乳动物的细小病毒进行了比较。MDPV FM株核苷酸长为5132 bp，GPV B株核苷酸长为5106 bp，两者在核苷酸水平上有81.9%相同。GPV 全基因结构见图1。

图1 GPV 基因组结构图(5106 bp)Fig.1 Genome structure of GPV(5106 bp)

贺娟［7］(2007)将GPV和MDPV的基因序列进行了比对:(1)GPV 179～4910 bp 序列与MDPV187～4927 bp 序列方向相同，同源性为82%;(2)GPV 4919～5105 bp与MDPV187～1的同源性为85%，但方向相反;(3)GPV93～177 bp 序列与MDPV 5083～4998 bp 同源性为94%，但方向相反;(4)GPV的2～151 bp 序列与MDPV5132～4980 bp同源性为88%，方向也是相反。GPV 较MDPV 基因组序列少的26 bp 分布于:左侧ITR 序列中，GPV 缺失11 bp;右侧ITR中，GPV 较MDPV少10 bp;在结构蛋白(VP)终止子后，GPV 较MDPV 少5 bp。GPV 较MDPV 基因组序列少的26 bp全部分布于非编码序列中。GPV 较MDPV 基因组中编码蛋白质的区域，两者之间大小相同，不存在缺失或额外的插入序列，而是表现为碱基替代。张云等［8］(2008)发现鹅和番鸭细小病毒非结构蛋白基因(NS)全长为1884 bp，编码627个氨基酸;结构基因(VP)全长为2199 bp，编码732个氨基酸;鹅细小病毒和番鸭细小病毒NS 之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为80.9%～82.9%和89.5%～91.2%，而鹅细小病毒间为93.7%～99.8%和96.8%～99.7%，番鸭细小病毒间为98.8%～99.8%和98.6%～99.5%;鹅细小病毒和番鸭细小病毒VP1之间核苷酸和氨基酸同源性分别为79.7%～88.7%和85.5%～93.3%，而相应的鹅细小病毒间为88.8%～99.6%和91.5%～99.2%，番鸭细小病毒间为98.1%～99.6%和97.1%～98.8%。娄华等［9］(2001)将MDPV－Q VP2蛋白基因序列与GPV VP2蛋白基因序列进行了比较，发现其同源性只有80.5%。季芳等［10］(2004)比较了MDPV GD株和GPV GD株，基因组同源性达81.30%，VP1基因编码的核苷酸的同源性为87%，VP2基因核苷酸同源性为84%，VP3基因核苷酸同源性为80%。两种病毒的VP2至VP3起始密码子之间的核苷酸存在较大差异，其同源性仅为64%。GPV和MDPV的Rep 基因的同源性达90.6%。孔宪刚等［11］(2005)将GPV HG5/82株基因与MDPV的NS 基因进行序列比较，核苷酸同源性为81%，氨基酸同源性为89%，有65个氨基酸发生变异，主要集中在NS 蛋白的羧基端。将HG5/82与国外发表的MDPV FM株的结构基因进行比较，其核苷酸及氨基酸序列同源性分别为80%和85%。其中有102个氨基酸发生变异，主要集中在VP2和VP3起始密码子之间的146～198位氨基酸。GPV VP2起始密码子为不典型的ACG，而MDPV VP2的起始密码子为典型的ATG。GPV 结构基因中的4个糖基化位点有3个，与MDPV 相同，而位于结构基因700～702位的NFS 在MDPV中变为NFG。MDPV结构基因共有6个糖基化位点，位于3个结构基因的共同区。GPV与MDPV 氨基酸序列在440～530位变化较大，其中GPV 结构基因在443～445位为NFN，而MDPV 在此为糖基化位点NFS;GPV 在493～495位为NWN，而MDPV 为NWS。糖基化位点与病毒和宿主细胞的吸附有关，是病毒感染宿主的必需区，因此推测这些糖基化位点的差异可能与病毒感染宿主的特异性有关。程由铨等［12］(2001)采用限制性核酸内切酶酶切技术对MDPV和GPV退火形成的双链DNA和经Klenow 酶合成的双链DNA 进行分析，证明MDPV和GPV 核酸的EcoR I、Kpn I和Sac I 酶切位点不同，合成的双链MDPV和GPV 核酸的Sac I、BstX I、Bg Ⅲ、Pst I和EcoR I 酶切位点不同，从而表明MDPV和GPV 核酸在结构上有明显差异。李雪梅等［13］(2001)对国内4株GPV和2株MDPV的Rep 基因进行酶切分析比较，发现酶切位点有较大差异，即GPV 缺乏Sac I位点，但有Pst I 位点，不同毒株间EcoR I 位点有差异;而MDPV 则有Sac I和EcoR I 位点，但无Pst I位点。

2 病毒编码蛋白比较

根据核苷酸全序列分析，基因组有两个开放阅读框(ORF)，左侧阅读框(LORF)编码非结构蛋白(Rep1，Rep2)，右侧阅读框(R0RF)编码3种核衣壳蛋白VP1、VP2、VP3，这3种蛋白起始密码子位于不同部位，但终止密码子处于同一位置。关于MDPV对其结构蛋白说法不一，法国学者C.LeCall－Recule等［14］(1994)进行SDS－PAGE 电泳时，发现在51kD 左右处有1条淡染的蛋白带;匈牙利学者Z.Zadori［6］(l995)根据蛋白凝胶电泳分析，MDPV 有3条结构多肽，分子量分别为VP191kD、VP278kD、VP358kD。而我国孟松树等［15］(1994)、王永坤等［16］(2004)研究表明，MDPV 有4条结构多肽，分别为VP1、VP2、VP3、VP4，分子量分别为VP189kD、VP268kD、VP358kD、VP4为40kD。其中，VP3为主要结构多肽，占总含量的78.5%，而VP1含量为9.4%，VP2为7.2%，VP4为4.9%。GPV出现3条结构多肽，即VP1分子量为85000，VP2为61000，VP3为57500。其中，VP3为主要结构多肽，占总含量的79.9%，而VP1为8.3%，VP2为11.8%。Chapaman等［17］(1993)分析了几种细小病毒粒子核衣壳，发现GPV、MDPV 位于病毒粒子表面的VP3多肽略有差异。最大不同之处是位于VP2、VP3启动子之间162位和178位氨基酸，而其蛋白分子差异不明显。张建珍等［18］也报道MDPV、GPV 有一定的交叉反应性，两者的共同抗原基因主要位于VP3上，而主要差异存在于VP1和VP2。Chu等［19］发现，GPV与MDPV 差异最多的序列集中于VP3的203－266及482－534位的氨基酸残基(VP1的401－464和680－732位氨基酸残基)。黎明等［20］采用生物信息学方法，预测MDPV和GPV 非结构蛋白可能发生交叉反应的区段为AA503－509。衣壳蛋白可能发生交叉反应的区段为AA321－325、426－430、540－544和685－691。

3 鉴别诊断方法

3.1 动物感染试验

MDPV 只能感染番鸭及番鸭源细胞，而GPV既能感染鹅，又可以感染番鸭及其体外培养细胞［21］。林世棠［22］、程由铨等［23］将MDPV 经各种途径接种雏番鸭、雏半番鸭、雏鹅、5日龄莆田黑鸭、6日龄樱桃谷鸭、北京鸭和杂种鸭，只有雏番鸭于接种后3～7 d 出现与自然患病相似的临床症状，发病率为52.6%，致死率为47.4%，其他水禽观察20 d 均健活。Glavits等［24］将3株从水禽分离的细小病毒(两株为鹅细小病毒，1株为番鸭细小病毒)人工感染3周龄的雏鹅和雏番鸭，结果3株细小病毒均能引起雏番鸭发病，而两株鹅细小病毒仅能使雏鹅感染发病。

3.2 血清学试验

王永坤等［4］采用交叉免疫转印试验发现，MDPV的多抗与MDPV、GPV 都出现了两条反应带VP3、VP2;GPV的多抗和MDPV 只有1条反应带VP3，与GPV 出现3条反应带VP1、VP2、VP3;MDPV 单抗仅识别MDPV和GPV的VP3，GPV 单抗在识别GPV VP3和VP2的同时，还识别MDPV的VP3。说明MDPV和GPV的共同抗原主要在占整个衣壳蛋白比例大的VP3上，两者的VP1和VP2存在差异。程由铨等［25］(1997)、胡奇林等［26］(2000)通过ELISA、FA、NT、AGP、LPA 试验对番鸭细小病毒和鹅细小病毒抗原进行分析，番鸭细小病毒单抗只与番鸭细小病毒发生特异性反应，与小鹅瘟病毒不发生特异性反应;小鹅瘟病毒单抗只与小鹅瘟病毒发生特异性反应，不与番鸭细小病毒发生特异性反应，表明两者在抗原结构上存在显著差异，同时明确了送检病料中以肝、脾组织为首选材料。抗原性上的高度同源给用血清学方法鉴别诊断这两种疾病造成了困难，在ELISA、FA、NT和LA等血清学检测方法中，只有应用MDPV和GPV 克隆抗体才能将这两种病毒区分开来。

3.3 PCR 技术

因GPV和MDPV的NS 基因酶切位点有较大差异，Sirivan等［27］(1998)对来自泰国的17个毒株进行了PCR 扩增和DNA 分子杂交后，采用限制性内切酶消化PCR 产物，有2株病毒不同于另外的15株，两株病毒无HincⅡ和Bg Ⅲ，而有EcoR Ⅰ位点，采用限制性片段长度多态性PCR－RFLP(Polymerase Chain Reaction－Restriction Fragment Length Polymorphism)分析PCR 产物可用于区分MDPV和GPV。

娄华等［28］(2000)比较了GenBank中MDPV和GPV的基因序列，并针对这两种病毒NS 基因序列的相同区段，分别设计了两对PCR 引物。引物LHMP1/LHMP2只特异地扩增MDPV，而引物LHGP1/LHGP2也只特异性地扩增GPV，并且两对引物均扩增出约720 bp的长度序列，为两种疾病的准确、快速鉴别诊断奠定了基础。胡奇林等［29］(2001)在MDPV和GPV 基因组保守区设计了1对通用引物(PC1/PC2)，在MDPV和GPV 基因组的非同源区设计了1对MDPV 特异引物(PS1/PS2)，建立了能对番鸭胚尿囊液和细胞培养液中的MDPV和GPV 进行快速诊断和鉴别诊断的PCR 检测技术。季芳等［30］(2003)在NS 区设计了1个通用引物PVC，在MDPV、GPV 非同源区设计了各自的特异性引物MDPVdn、GPVdn，其中PVC/MDPVdn能特异鉴别MDPV的存在，PVC/GPVdn 能特异鉴别GPV的存在，若将3种引物置于同一反应体系中，能鉴别两种病毒同时存在。刘家森等［31］(2007)、季艳菊等［32］(2007)根据GPV和MDPV 基因组的非同源序列，分别设计了针对GPV和MDPV的引物。但所设计引物仅能扩增特定病毒的核酸片段，对其他病毒核酸没有扩增。贺娟［7］(2007)在VP1基因中寻找同源性较低的两处，设计的引物能特异性地扩增出GPV的条带，而对照毒株不能扩增出470 bp的条带。鲜思美［33－34］(2009，2010)针对两种病毒NS和VP1基因序列的相同区段设计了两对引物，建立了番鸭细小病毒与鹅细小病毒PCR 鉴别诊断方法;并设计了针对GPV NS和MDPV NS2－ VP1基因片段的两对引物，建立了能同时检测这两种病毒的双重PCR。

4 小结

鹅细小病毒与番鸭细小病毒在病毒大小、形态结构、理化特性、核酸类型、免疫学特性等方面极为相似。两者的差异主要表现为:(1)致病特性，MDPV 仅感染雏番鸭，而GPV可感染雏番鸭和雏鹅;(2)抗原性方面，MDPV与GPV 用常规血清学作交叉和试验，有较明显的交叉保护作用，但用单克隆抗体作ELISA、FA等发现有不交叉的抗原成分;(3)MDPV和GPV 在核酸序列上有明显差异，可针对两种病毒的非同源区设计引物，采用PCR 技术对这两种疾病进行鉴别诊断。除此之外，也可采用限制性内切酶技术、PCR 产物结合测序的方法和PCR－RFLP对这两种细小病毒进行鉴别诊断。

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