人类性别决定基因（SRY）的检测及其临床应用

陈勇周华蓉林晓容

•论 著•

人类性别决定基因（SRY）的检测及其临床应用

陈勇1★周华蓉2林晓容3

目的探讨SRY基因与两性性别发育的关系。方法提取40例健康人外周血总DNA，加入SRY基因的特异性扩增引物和内参引物，运用聚合酶链式反应（PCR）技术进行 SRY基因扩增，后经琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果40例的基因组DNA经 PCR扩增后在500 bp和600 bp之间出现β-actin条带，与预期的大小为517 bp的β-actin片段相吻合，说明本实验的实验条件的可靠性和准确性。其中20例男性在600 bp至700 bp之间出现条带，与预期的SRY的677 bp 片段大致相符，而20例女性则无677 bp 片段产生。用该方法检测一例外生殖器异常，染色体为46，XY社会性别为女性的患者，其SRY检测结果为阳性。结论SRY基因阳性是雄性决定基因，用PCR技术扩增SRY 基因能快速准确检出Y染色体。SRY基因的检测对性连锁遗传性疾病和单基因突变病的无创性产前诊断有重要意义。

SRY基因 ； PCR

20世纪80年代英国科学家分离并获得高度保守的单拷贝基因，同时发现在染色体上只要有该基因就能发育为雄性。1990年SRY（Sex determing region on Y chromosome）基因的发现是人类性别决定领域的重大突破[1]。SRY指Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段。人的SRY基因位于Yp11.3，只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约1.1 kb，编码一个204氨基酸的蛋白质[2]。自Sinclairt J从Y短臂上的1A1区域分离出SRY基因以来，已有大量证据表明SRY 在性别决定及分化过程中起着非常重要的作用，是人类睾丸决定因子（testis determing factor，TDF）的最佳候选基因[3]。2003年6月19日,佩基实验室和华盛顿大学基因测序中心的合作者们，发表了Y染色体DNA序列及其分析，其中很多有趣和重要的发现。Y染色体测序结果也许是迄今人类基因组测序中结果最有趣的。我们知道一些遗传病与性别有一定关系的[4]，例如Y连锁遗传病中的外耳道多毛症，这种病只发生在男性身上，如能及时检测出SRY基因则能很好地避免悲剧的发生，减少家庭及社会的负担，因此探索SRY基因对医学，遗传学，优生学，动物育种学，法医学等领域的研究和应用具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 对象

2009年9月期间的健康体检标本40例，其中正常男性和女性各为20例，正常女性样本可以作为该SRY基因扩增的阴性对照。

1.1.2 提取外周血DNA试剂

采用的是北京天根全血基因组DNA提取试剂盒。

1.1.3 PCR 试剂

PCR扩增试剂均为Promega公司产品，包括耐热DNA聚合酶（5 U/μL），MgCl2（25 mmol/L）和10×Reaction Buffer。

1.2 方法

1.2.1 人外周血DNA的提取

严格按照北京天根全血基因组DNA提取试剂盒说明书进行。

王登佩把那包猪头肉放在餐桌上摆好，颖春给我们炒了两菜便出去守杂货店了，我从消毒柜里拿出酒杯筷子，两人便喝了起来。

1.2.2 目的片段的扩增

1.2.2.1 设计引物

参照参考文献[5]并运用Primer5.0软件进行设计，引物序列见表1：

1.2.2.2 PCR 反应体系

通过参照参考文献[6]，最终确定反应体系如表2：

1.2.2.3 循环参数

94℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，34个循环，72℃延伸10 min，然后4℃保存。

1.2.3 电泳检测

取PCR产物8 μL，在含有0.5 µg/mL溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。电泳条件：电压100 V，时间50 min。凝胶成像分析系统观察电泳结果。

1.2.4 测序验证

将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收纯化后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，将测序产物经BLAST比对，完全符合SRY基因序列。

2 结果

2.1 SRY基因扩增结果

40例的基因组DNA经 PCR扩增后在500 bp和600 bp之间出现β-actin条带，与预期的517 bp的β-actin片段相吻合，说明本实验的实验条件的可靠性和准确性。其中20例男性在600 bp至700 bp之间出现条带，与预期的SRY 677 bp 的片段大致相符，而20例女性则无677 bp 片段产生，由此可得出结论SRY是男性决定基因。图1为40例正常男女的PCR结果。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

图1 40例正常男女的PCR结果Figure 1 The PCR result of 40 cases of normal male and female

PCR结果：1～8号、17～24号、33～36号泳道为正常女性，9～16号、25～32号、37～40号泳道为正常男性，M泳道为杭州博日公司的DL-100 Marker。

2.2 SRY基因的部分测序图

将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，切割下含SRY部分琼脂糖经DNA纯化后进行测序分析，图2显示的是部分测序的图谱，经NIBI BLAST比对后完全符合SRY基因序列。

图2 SRY基因的部分测序图Figure 2 Sequencing diagram of SRY gene

2.3 SRY基因检测的临床应用

一例15岁社会性别为女性的患者，以月经未来潮来我院妇产科就诊，后经B超诊断为先天性无子宫，后经染色体检查，其核型为46，XY。结论为染色体性别与社会性别不符。其核型图及SRY电泳图如图3，图4所示。

图3 患者的核型图Figure 3 Karyogram of patient

图 4 患者的PCR结果Figure 4 PCR result of patient

3 讨论

以往的研究表明[7]，SRY基因在睾丸发育早期，发挥短时间的启动作用，可调节某些基因，但又受制于另一些基因，这些基因相互作用，决定着性别的分化发育。人类性别的形成包括性别决定和性别分化2个过程, 性别决定属于XY型，即由性染色体XX决定女性、XY决定男性。胎儿时，人类性别发育就由Y染色体上的性别决定基因而决定，此基因突变、易位或缺失可导致发育异常[8]。Y染色体上95%是男性特异区域,里面含有和男性有关的基因，不和其它染色体进行DNA重组来交换遗传物质，不重组导致遗传物质缺乏活力，不断积累坏的突变、又不能有效获得好的变化，这是Y染色体不断走向灭亡的主要原因之一。而性别分化除与性染色体有关外，还与诸多基因有关。一个正常男性的形成至少需要Y染色体上的睾丸决定因子（TDF）和H-Y抗原基因、X染色体上的AR基因、常染色体上的5-α还原酶基因等基因的协同作用。1990年，Sinclair等克隆到了Y染色体上的性别决定区域SRY。大量实验证明SRY是TDF的最佳候选基因，是人类性别形成的主要基因，但不是决定人类性别的唯一基因。人类性别的形成实际上是以SRY基因为主导的、多基因参与的、有序协调表达的生理过程[9]。

本实验基于对基因组DNA具有高度选择性的高分子膜材料，只需少数几个步骤即可完成提取过程，在短时间内完成高纯度DNA的提取，无需昂贵的设备，完全避免采用有毒或是具有危险性的试剂，如苯酚，氯仿等。在实验方法方面，为了最大限度地降低PCR的假阳性扩增，我们采用了样品制备和扩增隔离的方法以及抽换室内空气和全部使用一次性吸头、离心管。从而使污染控制到最低程度，保证了结果的准确性。

使用自行设计的引物进行SRY特异性基因的扩增，成功的应用于核型为46，XY患者的基因诊断，确认该患者是男性，从而为该患者的变性手术提供了可靠的诊断依据[10]。

实验结果显示SRY阳性是男性决定基因，PCR技术提高了检测SRY基因的特异性和灵敏度，缩短了操作时间，快速，准确，特异性强。

[1] 焉波, 张思仲. 人类SRY基因的研究进展[J]. 中华医学遗传学杂志, 1995, 12(5): 282-286.

[2] Alvarez-Nava F, Martínez M C, González S, et a1. Fish and PCR analysis of the presence of Y-chromosme sequences in a patient with Xq-isochromosome and testicular tissues[J]. Clin Genet, 1999, 55(5): 356-610.

[3] Ottolenghi C, McElreavey K. Deletions of 9p and the quest for a conserved mechanism of sex determination[J]. Mol Genet Metab, 2000, 71(1-2): 397-404.

[4] 陈红, 杜晓娟, 孙国贤, 等. 中国人SRY基因的分离、克隆及核苷酸序列分析[J]. 生物化学杂志, 1993, 9(2): 219-223.

[5] Bardoni B, Zanaria E, Guioli S, et al. A dosage sensitive locus at chromosome Xp21 is involved in male to female sex reversal[J]. Nat genet, 1994, 7(4): 497-501.

[6] 易萍, 李力, 颜耀华, 等. 应用母亲血浆常规PCR技术进行胎儿性别鉴定[J]. 中国妇幼保健, 2006, 21(6): 836-837.

[7] Koopman P, Gubbay J, Vivian N, et al. Male development of chromosomally female mice transgenic for Sry[J]. Nature, 1991, 351(6322): 117-121.

[8] 王崇新, 马咸成, 叶大勋, 等. 多聚酶链式反应检测睾丸女性化综合征患者的Y染色体[J]. 中国优生与遗传杂志, 1996, 4(5): 26-27.

[9] Wu J B, Chen K, Li Y, et al. Regulation of monoamine oxidase A by the SRY gene on the Y chromosome[J]. FASEB J, 2009, 23(11): 4029-4038.

[10] Akbas E, Soylemez F, Hallioglu O, et al. Analysis of the SRY gene in a girl with 45, X/46, XY genotype[J]. Genet Couns, 2009, 20(3): 249-254.

The detection and clinical application of human sex determination gene on Y chromosome by PCR

CHEN Yong1★, ZHOU Huarong2, LIN Xiaorong3
(1.Department of Medical Laboratory, First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fujian, Fuzhou 350005, China; 2.Department of Hematology, Af fi liated Union Hospital of Fujian Medical University, Fujian, Fuzhou 350001, China; 3.Department of Medical Laboratory, Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fujian, Quanzhou 362000, China)

Objective To investigate the relationship between sex determination gene on Y chromosome (SRY) gene and sexual development. Methods Peripheral blood total DNA were extracted in 40 cases of healthy persons, which adding SRY gene-speci fi c ampli fi cation primers and internal control primers. Then the SRY gene were ampli fi cated by polymerase chain reaction (PCR) technology and detected by agarose gel electrophoresis. Results 40 cases of genomic DNA appeared β-actin bands between 500 bp and 600 bp after PCR ampli fi cation, which coincided with the expected size of 517 bp of β-actin fragment, showed that the experimental conditions were reliable and accurate. 20 cases of male appeared bands between 600 bp and 700 bp, which coincided with the expected size of 677 bp fragment, while 20 cases of female without 677 bp fragment. A case of genital abnormalities patient was detected by this method, which chromosome as 46, XY, gender female, and the SRY test result was positive. Conclusion SRY gene was male-determining gene, which ampli fi ed by PCR, could be rapidly and accurately detected on the Y chromosome. It is important to detect the SRY gene for the non-invasive prenatal diagnosis of sex-linked genetic diseases and single gene mutation disease.

Sex determining region on Y chromosome； PCR

1.福建医科大学附属第一医院检验科，福建，福州350005 2.福建医科大学附属协和医院，福建，福州 350001 3.福建医科大学附属第二医院检验科，福建，泉州 362000

★通讯作者：陈勇，E-mail:chenyon_bear@yahoo.com.cn