米力农对兔脑血管痉挛后NO/cAMP信号通路关键酶的作用研究※

王立君邵正凯牟青春梁绍栋王 闯李金库

米力农对兔脑血管痉挛后NO/cAMP信号通路关键酶的作用研究※

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目的研究米力农对兔蛛网膜下腔出血（SAH）后脑血管痉挛的作用及潜在机制。方法实验通过枕大池注血建立兔SAH模型。采用CT血管成像（CTA）和经颅多普勒超声（TCD）测量实验动物基底动脉的管径和血流速度，并对动物血浆和脑脊液中一氧化氮（NO）浓度进行测定。结果与对照组相比SAH动物的基底动脉管径变细、血流速度增快，血浆及脑脊液NO浓度降低。同时，SAH动物基底动脉eNOS的表达下降。米力农给药组SAH动物平均基底动脉管径增粗而血流速度下降、血浆及脑脊液中NO浓度升高，基底动脉eNOS接近对照组水平，而L-NAME（NOS阻断剂）可阻断米力农的药理作用。结论NO/cAMP信号通路在下腔出血后脑血管痉挛的发展中起到重要作用。米力农在一定程度上是通过修复SAH后受损的NO/cAMP信号通路起到缓解脑血管痉挛的作用。此外，NO/cAMP信号通路可做为防治脑血管痉挛的重要靶点。

脑血管痉挛；NO/cAMP信号通路；蛛网膜下腔出血；米力农

研究显示，30%～70%的动脉瘤性蛛网膜下腔出血（aSAH）患者在出血后会发生脑血管痉挛[1]。极易造成脑组织缺血、缺氧，甚至引起脑梗死等严重结果。本课题以兔SAH模型为基础，研究米力农对SAH后脑血管的影响作用，及其可能的作用机制，为研究新药及新的药物靶点打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组健康普通级3个月龄日本大耳白兔32只体质量2.3～2.6kg。随机分为SAH组、假手术组、米力农组及NOS阻断剂组，每组8只。

1.2 模型建立采用枕大池二次注血法建立 SAH模型。假手术组枕大池内注入等量等渗盐水替代自体血。米力农组，SAH模型后，耳源静脉注射米力农溶液（鲁南制药集团，剂型5mg/5ml）30μg/kg，等渗盐水稀释至5ml。米力农+N-硝基-左旋精氨酸甲酯（L-NAME）组，造模后，先耳源静脉注射米力农溶液30μg/kg，再注射 L-NAME（30mg/kg，美国Sigma公司，0.6%/kg），共5ml（等渗盐水稀释）。四组均连续给药3d，1次/d。

1.3 SAH模型及米力农药效评价

1.3.1 经颅多普勒超声（TCD）检测基底动脉血流速度：于SAH后第3天动物处死前，采用德国Ueberlingen公司TCD仪行脑血流评价。

1.3.2 CT血管成像（CTA）检测量基底动脉管径：取非注药侧耳源静脉穿刺，连接高压注射器。注入欧乃派克（0.5ml/s，碘含量300mg/ml）。采用最大密度投照技术（Maximum intensity projection,MIP）重建脑血管图像。分别测量基底动脉上段、中段和下段三处血管直径，取三点的平均值做为基底动脉管径。

1.4 检测血浆、脑脊液中一氧化氮（NO）浓度利用硝酸还原酶特性将NO3-还原为NO2

-通过显色深浅测定NO浓度高低。取出-80℃保存之备用血浆及脑脊液，室温下解冻备用。试剂盒由试剂1～7以及10mmol/L标准品（0.5ml）组成。试剂5为过饱和溶液，由100℃双蒸水20ml，隔水加热，玻棒搅动充分溶解，避光保存；试剂6加入双蒸水8ml，避光冷藏保存。配制混合试剂：试剂1和2以1：1浓度配制。配制显色剂：试剂5：试剂6：试剂7按2.5：1：1浓度配制。配制100μmol/L标准液：取0.1ml标准品用双蒸水定容稀释至10ml。

标本制作：取三个清洁试管标注为空白管、标准管和测定管，分别加入蒸馏水0.1ml、标准溶液0.1ml和样本液0.1ml，均加入0.4ml混合液。混均，放入37℃准确水浴60min，分别向三支试管中再加入试剂3为0.2ml和试剂4为0.1ml。充分涡旋30s，室温静置40min，3500～4000转/min，离心10min，取上清液0.5ml，分别加入显色剂0.6ml。混匀后室温静置10min，蒸馏水调零，550nm，0.5cm光径，紫外分光光度计测各管吸光度值。按下列公式计算血浆及脑脊液中NO含量：

NO（μmol/L）=（测定管吸光度－空白管吸光度）/（标准管吸光度－空白管吸光度）×标准品浓度（μmol/L）×样品测试前稀释倍数。

1.5 统计学分析各参数以均数±标准差（Mean± SD）表示，计量资料组间比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA）。采用SAS 6.0统计软件协助处理数据，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况实验动物在手术操作及注药后均得以存活，动物在枕大池注血后出现不同程度的萎靡、少动但无神经功能缺失。

2.2 基底动脉血流速度及管径变化术后3天，TCD检测显示，SAH组基底动脉平均MFV和PSV均高于假手术组和米力农组，差异均有统计学意义；假手术组与米力农组比较MFV和PSV差异均无统计学意义。而米力农＋ L-NAME组MFV和PSV明显高于假手术组和米力农组，接近于SAH组。

CTA检测结果显示，SAH组基底动脉平均管径明显细于假手术组和米力农组（差异均有统计学意义），且可见明显的串珠样血管痉挛改变。假手术组与米力农组比较血管管径差异均无统计学意义。而米力农＋L-NAME组基底动脉管径明显细于假手术组和米力农组，接近于SAH组，见表1。

2.3 血浆、脑脊液中一氧化氮(NO)浓度测定假手术组动物血浆中NO浓度为（74.69±8.05）μmol/L，枕大池注血后动物血浆NO平均水平显著下降，达到（20.49±2.84）μmol/L，两组相比有统计学差异（P＜0.05）。静脉注射米力农后SAH动物血浆中NO水平增至（71.75±5.31）μmol/L，与SAH组相比有统计学差异（P＜0.05），而与假手术组相比P＞0.05。继续给予NOS阻断剂L-NAME后，血浆NO水平下降到（18.28±2.09）μmol/L，与假手术组和米力农治疗组相比有统计学差异（P＜0.05），与SAH组相比无统计学差异。

假手术组动物脑脊液NO平均浓度为（25.21± 2.81）μmol/L，SAH动物脑脊液NO浓度为（16.26 ±1.34）μmol/L，两者相比有统计学差异（P＜0.05）。模型动物静脉注射米力农，平均脑脊液NO浓度为（23.02±2.09）μmol/L，与SAH组相比有统计学差异（P＜0.05）。模型动物在给予米力农基础上，再给予NOS阻断剂L-NAME，脑脊液平均NO浓度为（13.02±1.83）μmol/L，与前三组比较均有统计学差异（P＜0.05）。

表1 各组大白兔术后第3天基底动脉血流速度及管径及NO浓度的比较(±s)

表1 各组大白兔术后第3天基底动脉血流速度及管径及NO浓度的比较(±s)

组别 兔数(只) MFV (cm/s) PSV (cm/s)基底动脉管径(μm) NO浓度(μmol/L)假手术组 8 19.4±1.826.7±4.8 1127±14074.69±8.05 SAH组 8 32.7±4.245.2±3.6 772±116 20.49±2.84米力农组 8 17.8±1.829.3±3.3 1113±10171.75±5.31米力农+ L-NAME组8 33.2±7.243.9±4.1 802±91 18.28±2.09F39.42 26.04 19.41 33.21P＜0.001＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

米力农（Milrinone，甲氰吡酮、米力酮）是人工合成的第2代PDEⅢ抑制药物，化学名为1,6-二氢-2-甲基-6-氧基-（3,4,-二吡啶）-5-腈。兼有正性肌力作用和血管扩张作用（动脉和静脉）。目前，米力农广泛应用于治疗急性充血性心衰患者[2]。

米力农正性肌力作用主要是通过抑制磷酸二酯酶，血管平滑肌细胞中的环磷腺苷含量增加后，激活蛋白激酶使钙离子外流，钙离子内流受阻，收缩期血管平滑肌细胞内钙离子浓度下降，平滑肌兴奋收缩偶联过程受抑制，动、静脉血管扩张，故PDEⅢ抑制药物可通过调节血管胞浆钙离子的浓度，使血管扩张[3]。

Khajavi对下腔出血的狗模型应用米力农0.05 mg/kg连续应用8天后行脑血管造影其血管管径及动力学明显改善，但具体机制未明[4]。众所周知，蛛网膜下腔出血血浆中NO的浓度变化对脑血管痉挛起着决定性作用。本实验结果显示，在应用米力农后，蛛网膜下腔出血的兔无论是血管管径、血流速度均有所改善，提示米力农确实有改善脑血管痉挛的作用。在米力农给药基础上继续给予L-NAME，而L-NAME是常用的NOS阻断剂，可有效抑制eNOS活性[5]，故进一步提示米力农的扩血管药理作用可能与调节NOS有关。

TCD和CTA的检测结果，eNOS功能异常在脑血管痉挛的发生、发展中起到积极作用。为明确脑血管痉挛后eNOS功能异常对下游NO的影响作用，笔者对实验动物血浆及脑脊液中NO进行了测定。本实验采用硝酸还原酶法检测血浆和脑脊液中NO浓度，与传统的金属镉还原法相比，硝酸还原酶法更加灵敏而稳定[6]。实验结果显示，SAH后血浆及脑脊液中NO浓度显著下降，与假手术组相比有统计学差异，表明脑血管痉挛时动物体内的NO生成减少。米力农给药组动物血浆及脑脊液平均NO浓度显著增高。米力农能上调脑血管痉挛后受损的eNOS表达，并通过间接促进NO释放引起脑血管扩张。米力农给药后再给予L-NAME则eNOS表达下调，同时NO水平随之显著下降，表明L-NAME抑制米力农诱导的eNOS表达继而抑制NO生成。在NO/cAMP信号通路中，较高的cAMP水平有助于下游信号的正常传递。因此，无论是促进cAMP生成，还是减少cAMP水解均有助于维持NO介导的内皮源性血管舒张作用。多年前即有学者在痉挛血管局部应用罂粟碱，利用其非特异性磷酸二酯酶（PDE）抑制作用减少cAMP降解，取得较好的扩血管效果[7]。

综上所述，本实验结果表明米力农的脑血管扩张作用可能与其调控NO/cAMP信号机制，促进NO生成有关。但米力农是如何作用于NO/cAMP信号的起始关键酶eNOS从而引发一系列下游事件，这一机制仍有待阐明。

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R743

A

1673-5846(2013)08-0215-03

1牡丹江医学院红旗医院神经外科，黑龙江牡丹江 157011

2哈尔滨医科大学第四临床医学院神经外科，黑龙江哈尔滨 150000

黑龙江省卫生厅科研课题（2011-294）

王立君（1972.1-），男，汉族，山东莱州人，硕士研究生，副主任医师，研究方向：脑血管病的显微及血管内治疗。