春夏季辽宁盘锦地区土池培养的小球藻总脂肪含量和脂肪酸的组成分析

陈炜,白永安,李晓东,赵文

(1.大连海洋大学辽宁省水生生物学重点实验室,辽宁大连116023;2.盘锦光合蟹业有限公司,辽宁盘锦124200)

春夏季辽宁盘锦地区土池培养的小球藻总脂肪含量和脂肪酸的组成分析

陈炜1,白永安2,李晓东2,赵文1

(1.大连海洋大学辽宁省水生生物学重点实验室,辽宁大连116023;2.盘锦光合蟹业有限公司,辽宁盘锦124200)

研究了2008—2010年春夏季(3—8月)辽宁省盘锦地区小球藻Chlorella pyrenoidesa体内总脂肪含量和脂肪酸组成的变化规律。结果表明:春季(4—6月)采集的小球藻粗脂肪含量显著高于初春(3月)和夏季(7、8月);采集的小球藻脂肪酸中多不饱和脂肪酸(PUFA)含量,3—5月逐渐上升,6—8月显著下降(P＜0.05),其中4、5月PUFA含量均较高,约占总脂肪酸的51%,主要是二十碳五烯酸(EPA)的含量增加;小球藻脂肪酸中饱和脂肪酸(SFA)含量的变化规律与PUFA相反,单不饱和脂肪酸(MUFA)含量的波动较小。研究表明,4—5月是盘锦地区室外土池培养小球藻的最佳收获期。

小球藻;脂肪;脂肪酸

小球藻Chlorella pyrenoidesa是鱼、虾、双壳类等多种养殖动物幼体重要的天然饵料。小球藻的营养价值主要取决于自身多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)的含量。小球藻的脂肪含量和脂肪酸组成与环境因子(光照、温度、盐度、pH等)密切相关[1-2],因此,室外培养的小球藻,其营养价值会随季节的变化而变化。

盘锦辽河三角洲地区具有自然条件的优势,生产中常采用室外土池来大规模培养小球藻。虽然室外培养小球藻的技术比较成熟,但与室内培养相比,受环境因子的影响较大。为了定量分析池塘培养的小球藻的营养组成,笔者连续3年采集了该地区春夏季的小球藻样本,研究了室外土池培养小球藻体内总脂肪含量和脂肪酸组成的季节变化规律,以期为盘锦地区在室外土池培养高质量小球藻提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidesa采自盘锦光合蟹业有限公司三角洲养殖场的池塘,采样时间为2008—2010年每年3—8月。培养池为户外土池(长×宽为15 m×5 m),水深约40 cm。土池中小球藻为单种培养,并根据水色和经验适时进水和施肥,在生长旺季每隔2～3 d施以无机肥[w(碳酸氢铵)∶w(过磷酸钙)=10∶1]或粪肥(20～50 g/m3),全池均匀泼洒。试验期间水温,3月为2～5℃,4月为5～15℃,5月为15～22℃,6月为20～24℃,7月为24～26℃,8月为25～29℃(不同年份略有差异);盐度为15～30。定期测定藻细胞密度,一般在小球藻进入稳定生长期后采收,藻细胞密度为1 000×104～2 000×104cell/mL。新鲜藻液经GF-105型管式高速分离机(16 000 r/min)离心,藻膏于-24℃下保存待测。

1.2 方法

粗脂肪的提取方法和脂肪酸甲酯的制备参照文献[3]中的方法。

用日本岛津GC-2010型气相色谱仪分析脂肪酸。色谱条件:色谱柱为FFAP抗氧化交联石英毛细管柱(中国科学院大连化学物理研究所产品),规格为30 m×0.25 mm×0.3 μm;进样口温度为260℃,分流比为100∶1;载气为高纯N2,柱流量为1 mL/min,柱温由160℃以2℃/min的速度升至230℃,保持至出峰完毕;FID检测器,温度为230℃。色谱峰的鉴定采用部分脂肪酸甲酯标准样品(SIGMA公司和上海试剂一厂产品)与ECL值相结合的方法[4-6],采用面积归一化法进行定量分析。

1.3 数据处理

试验数据均用平均值±标准差表示,采用SPSS 17.0软件对试验数据进行方差分析和多重比较。

2 结果

2.1 小球藻粗脂肪的含量

从表1可见:4、5、6月采集的小球藻粗脂肪含量显著高于3、7、8月(P＜0.05);3月小球藻粗脂肪的含量最低,4月突增至最大,5、6月略微降低,7、8月明显减少。

表1 3—8月小球藻粗脂肪的含量(鲜质量)Tab.1 The crude fat content in green algae Chlorella pyrenoidesa from March to August(wet weight) %

2.2 小球藻脂肪酸的组成

从表2可见:3—8月小球藻主要脂肪酸种类没有变化,饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)中含量最高的分别为 C16∶0、C16∶1和 C20∶5n-3(EPA),且其含量随C16∶0、C16∶1和EPA含量的变化而变化;PUFA和EPA含量在3—5月逐渐升高,6—8月显著降低(P＜0.05),最高值均出现在4、5月,PUFA和EPA含量约占总脂肪酸的51%和42%,且显著高于其他月份(P＜0.05);SFA与C16∶0含量的变化规律为3—5月逐渐降低,6—8月显著升高(P＜0.05);MUFA与 C16∶1含量在3—8月波动较小; n-3/n-6值在3—5月较大(3.90～4.62),在6—8月较小(2.39～3.11)。

表2 3—8月小球藻脂肪酸的组成Tab.2 Fatty acid composition of green alga Chlorella pyrenoidesa from March to August %

3 讨论

在水产养殖中,多不饱和脂肪酸,尤其是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)为水产经济动物幼体生长和发育所必需,也是评价小球藻营养价值的主要指标。土池培养的小球藻中EPA含量较高,但未检测出DHA,脂肪酸组成与海洋小球藻相似[7-10],而与蒋霞敏等[11]对小球藻的测定结果差异很大。由于早期定名的混淆,将淡水小球藻和海水小球藻都命名为小球藻,但它们并非同一种微藻[7,9,11]。从脂肪酸的特点分析,土池培养的蛋白核小球藻应当属于海水小球藻,与蒋霞敏等[11]报道的小球藻很可能不是同一种。

小球藻脂肪含量和脂肪酸组成与环境因子密切相关,温度是重要的影响因素之一。李文权等[12]研究发现,在12、20、26℃水温下,小球藻的PUFA和EPA含量均在12℃时最高;曹春晖等[13]研究表明,在16、22、28℃水温下,3株小球藻总脂肪含量均在16℃时最高,EPA含量均在22℃时最高;Teoh等[14]研究发现,在 4、6、9、14、20、30℃水温下,从南极分离出的小球藻Chlorella UMACC237的PUFA含量在9℃时最高,在14℃时次之,而Chlorella UMACC234的PUFA含量在14℃时最高,在20、9℃时次之;樊云真等[15]研究发现,4、12月(水温为15～18℃)收获的球等边金藻Isochrysis galbana的DHA含量明显高于8月(水温为28～32℃),认为季节的差异主要由温度不同所致。上述研究表明,在小球藻正常生长的温度范围内,低温有利于脂肪和PUFA的积累。

盘锦辽河三角洲地区的池塘一般在3月中旬开始解冻,水温尚未达到小球藻生长和营养积累的最适温度;4—5月,随着气温的回暖,水温逐渐升高,一般在10～20℃,非常适合小球藻的生长以及脂肪和PUFA的积累;随着初夏和盛夏的来临, 6—8月水温上升至20～29℃,脂肪的积累开始减少,EPA和PUFA的合成亦受到抑制,故总脂肪含量以及EPA、PUFA的比例也随之下降。总之,不同月份小球藻总脂肪和脂肪酸的差异与温度密切相关,变化规律与上述研究结论基本一致。

光照是影响小球藻总脂肪含量和脂肪酸组成的另一个重要因素。李荷芳等[16〛[17]也得出相同结论,即随着光照强度(250、1 700、3 000、 6 400、9 900、18 000 lx)的增强,小球藻EPA和PUFA的含量下降。曹春晖等[18]对 3株小球藻Chlorella sp.MACC/C95、MACC/C97、MACC/C102的研究表明:C95的总脂肪含量随光照强度(3 000、5 000、8 000 lx)的变化不大,C97和C102的总脂肪含量则随光照强度的升高而明显升高;C95的EPA含量在中低光照强度下较高,在高光照强度下较低,C97和C102的EPA含量则随光照强度的增加而明显降低;3株小球藻的PUFA总量均随光照强度的增加而降低。

盘锦的水文资料[19]显示,盘锦地区全年平均日照为2 768.5 h,5月日照时数最高(278.5 h), 7月较低(216.8 h),11月最低(195.4 h)。日照百分比冬季高于夏季,其中1月的日照百分比最高(70%),8月最低(56%),主要是受雨季云量增多的影响。3、4、5月的盘锦地区光照时间逐渐增长,虽然光强也在逐渐增强,但尚未达到抑制小球藻PUFA合成的程度,故小球藻的总脂肪含量及EPA、PUFA含量随之增加。6月以后由初夏渐入盛夏,光照过强,EPA、PUFA的合成受到抑制,故又呈下降趋势。本试验结果体现出当地日照时间和日照强度的综合影响。

在室外土池培养小球藻的过程中,除了温度、光照等主要环境因素的影响之外,实际影响因素远比室内培养复杂得多。Reitan等[20]认为,在微藻生长过程中,随着营养限制程度的提高,n-3/n-6值下降。本试验中3—5月小球藻的n-3/n-6值较高,6—8月较低,这说明营养限制因素对小球藻的影响夏季大于春季,此时期更需要实时监测小球藻的生长及各项水质指标,及时施肥以保证小球藻的营养需求。此外,随着水温的升高,池塘中轮虫休眠卵开始孵化,轮虫多以小球藻为食,如不加以控制便会迅速繁殖。这种现象主要出现在5月以后。为了控制轮虫的数量有时不得不使用诸如漂白粉、强氯精之类的药物,这些药物在杀死轮虫的同时,也严重干扰小球藻的正常生长及营养合成,最终导致夏季小球藻生物量以及总脂肪、PUFA含量的降低。

总之,室外土池培养小球藻的影响因素极其复杂,综合考虑,盘锦地区春季的小球藻营养价值最高,4—5月是该地区土池培育的小球藻最佳收获时期。

致谢:在试验过程中,大连海洋大学李永函教授和雷衍之教授给予了精心指导和热心帮助,大连海洋大学2008届毕业生王保刚、2009届毕业生王秀芬、2010届毕业生梁明明参加了部分工作,在此表示衷心感谢!

[1]杨秀霞,于浩,曾晓起.影响微藻脂肪酸组成因素概述[J].海洋湖沼通报,2001(1):76-82.

[2]石娟,潘克厚.不同培养条件对微藻总脂含量和脂肪酸组成的影响[J].海洋水产研究,2004,25(6):79-85.

[3]陈炜,王秀芬,白永安,等.浓缩方法及保存条件对小球藻藻膏脂肪酸的影响[J].大连海洋大学学报,2012,27(1):1-5.

[4]Ackman R G.Analysis of oils and fats[M].London:Elsevies Appl Sci Pub,1986:137-206.

[5]Ackman R G.Simplification of analyses of fatty acids in fish lipids and related lipid samples[J].Acta Med Scand,1987,222:99-103.

[6]Christie W W.Equivalent chain-lengths of methyl ester derivatives of fatty acids on gas chromatography:a reappraisal[J].J Chromat, 1988,447:305-314.

[7]李荷芳,周汉秋.海洋微藻脂肪酸组成的比较研究[J].海洋与湖沼,1999,30(1):34-40.

[8]俞建江,李荷芳,周汉秋.10种海洋微藻总脂、中性脂和极性脂的脂肪酸组成[J].水生生物学报,1999,23(5):481-487.

[9]王大志,彭兴跃,李少菁,等.海水小球藻脂肪酸组成研究[J].海洋科学,1999,23(4):86-70.

[10]王明清,迟晓元,秦松,等.海洋微藻总脂含量和脂肪酸组成的测定[J].中国油脂,2008,33(11):67-70.

[11]蒋霞敏,郑亦周.14种微藻总脂含量和脂肪酸组成研究[J].水生生物学报,2003,27(3):243-247.

[12]李文权,李芊,廖启斌,等.温度对四种海洋微藻脂肪酸组成的影响[J].台湾海峡,2003,22(1):9-13.

[13]曹春晖,孙世春,麦康森,等.温度对四株海洋绿藻总脂含量和脂肪酸组成的影响[J].盐业与化工,2006,35(3):16-18.

[14]Teoh M L,Chu W L,Marchant H,et al.Influence of culture temperature on the growth,biochemical composition and fatty acid profiles of six Antarctic microalgae[J].Journal of Applied Phycology,2004,16(6):421-430.

[15]樊云真,刘发义,李荷芳.海洋微藻高度不饱和脂肪酸的研究Ⅱ:环境因子对球等边金藻3011中高度不饱和脂肪酸含量的影响[J].海洋科学集刊,1998,40:155-160.

[16]李荷芳,周汉秋.光照强度对海洋微藻脂肪含量及脂肪酸组成影响的研究[J].海洋科学集刊,2001,43:178-183.

[17]廖启斌,李芊,李文权,等.光辐射对海洋微藻脂肪酸含量的效应[J].海洋技术,2002,21(1):46-48.

[18]曹春晖,孙世春,麦康森,等.光照强度对四株海洋绿藻总脂含量和脂肪酸组成的影响[J].生态学报,2010,30(9):2347-2353.

[19]Casement.盘锦水文气候[EB/OL].[2007-09-24].http:// travel.mipang.com/bible/61834

[20]Reitan K I,Rainuzzo J R,Olsen Y.Effect of nutrient limitation on fatty acid and lipid content of marine microalgae[J].Journal of Phycology,1994,30(6):972-979.

Total lipid content and fatty acid composition in green alga Chlorella pyrenoidesa collected from Panjin in Liaoning Province during spring and summer

CHEN Wei1,BAI Yong-an2,LI Xiao-dong2,ZHAO Wen1
(1.Key Laboratory of Hydrobiology in Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Panjin Guanghe Crab Industry Co. Ltd.,Panjin 124200,China)

The total lipid content and the fatty acid composition were investigated in green alga Chlorella pyrenoidesa collected from Panjin in Liaoning province during spring and summer(from March to August during 2008-2010).The results showed that the green alga had significantly higher total lipid content in spring(April,May and June)than the alga collected in early spring(March)and summer(July and August).There was significantly higher percentage of polyunsaturated fatty acid(PUFA)in the green alga from March to May and lower from June to August,the maximum representing≈51%of the total fatty acid levels,predominant eicosapentaenoic acid(EPA),in May and April.The levels of saturated fatty acid(SFA)was decreased gradually from March to May, and significantly increased from May to August.The levels of monounsaturated fatty acid(MUFA)was found to be remained little change from March to August.Therefore,the optimal harvesting period of Chlorella pyrenoidesa from outdoor earthern culture ponds was of spring(April to May).

Chlorella pyrenoidesa;fat;fatty acid

S963

A

2013-04-11

国家海洋局海洋公益项目(201305005-02);大连海洋大学与盘锦光合蟹业有限公司合作科研项目(2012023)

陈炜(1968-),女,高级实验师。E-mail:chenwei@dlou.edu.cn

2095-1388(2013)06-0585-04