缺氧后适应与心肌营养素-1对心肌细胞缺氧复氧的保护作用及机制探讨

周贻军，赵亚男，赵 鑫，缪 绯，王先宝，颜 竞，张秀丽，刘映峰，杨平珍

(南方医科大学珠江医院，广州510280)

心肌营养素-1(CT-1)最初由Pennica等［1］在小鼠心脏胚胎干细胞中提取，因在体外具有促进心肌细胞生长的作用而命名为CT-1，其化学结构与IL-6相似，并且能与gpl30受体结合，归类为IL-6家族。在以往的研究中，CT-1只作为心肌疾病诊断和预后判断的标志物;最近的研究发现，其在心肌损伤中是一种重要的神经激素［2］。已有研究发现，缺血后适应可在缺血再灌注时保护心肌细胞［3］，即缺氧后适应在缺氧复氧时可保护心肌细胞，其机制可能与激活细胞外信号调节激酶(ERK1/2)通路有关［4］。2012年9月～2013年3月，本研究就CT-1与缺氧后适应对心肌细胞缺氧复氧损伤的作用及与ERK1/2通路的关系进行探讨。

1 材料与方法

1．1 材料 H9C2细胞株，由南方医科大学珠江医院实验室提供。新生牛血清、胎牛血清、DMEM-高糖培养基、青链霉素、PBS缓冲液。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Keygen，货号 KGA106)。phospho-p44/42 MAPK(Erk1/2)购自 Cell Signal Technology。Goat Anti-Rabbit IgG(H+L Chain Specific)购自Southern Biotech。定量PCR用酶SYBR Green PCR Master Mix购自TOYOBO公司。CT-1购于Peperotech公司。二甲基亚砜购于Sigma公司。内参抗体:HRP标记的优质内参，购于上海康成公司。

1．2 方法

1．2．1 细胞培养 H9C2心肌细胞株在含10%胎牛血清的DMEM-高糖培养基，37℃、5%CO2培养箱中培养，复苏细胞正常传2、3代后，取指数生长期的细胞进行实验。

1．2．2 实验分组及处理 正常对照组(a组):细胞用含10%新生牛血清的DMEM液正常培养，不经任何处理。缺氧复氧组(b组):采用pH 6．8 D-Hanks液在缺氧培养箱(95%N2、5%CO2、37℃)培养3 h;将pH 6．8的D-Hanks换成含10%新生牛血清的DMEM 液，在 MCO-17AICO2培养箱(95%O2、5%CO2、37℃)复氧3 h。缺氧复氧+缺氧后适应组(c组):在复氧前施加5 min复氧/5 min缺氧3个循环，其他同b组。缺氧复氧+缺氧后适应+CT-1组(d组):在缺氧3 h后加入10μg/L CT-1，5 min复氧/5 min缺氧3个循环，复氧3 h，其他同b组。缺氧复氧+缺氧后适应+CT-1+ERK抑制剂组(e组):在缺氧完成前30 min加入20μmol/L ERK抑制剂A6355，缺氧完成后加入10μg/L CT-1，5 min复氧/5 min缺氧3个循环，复氧3 h，其他同b组。缺氧复氧+缺氧后适应+CT-1+二甲基亚砜组(f组):ERK抑制剂换为二甲基亚砜，其他同e组。

1．2．3 细胞存活率检测 采用MTS法。取指数生长期细胞，调整细胞浓度为1×105/mL，每孔100μL加到96孔板中。收集各处理组细胞，按10∶1加入Cell Titer96AQ单溶液细胞增殖检测试剂，即100μL培养液加入10 μL检测液。95%N2、5%CO2、37 ℃孵育4 h后，酶标仪读板，酶联免疫检测仪读取OD490的数据记为A值，重复3次。细胞存活率=处理组A值/对照组A值×100%。

1．2．4 细胞凋亡率检测 采用流式细胞仪。心肌细胞以1×106/孔接种于培养板，2 mL PBS液轻润洗，以0．25%不含EDTA胰酶孵育使细胞从培养板壁上完全脱落，将细胞重悬，加入Annexin V-FITC，室温避光反应15 min，离心，去除上清。重悬细胞，加入Propidium Iodide，放置在冰上避光保存，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1．2．5 ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达检测 采用Western blot法。采用 Biorad法提取总蛋白20μg进行电泳分离。蛋白转印到PVDF膜，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h。分别加入ERK1/2和p-ERK1/2单克隆抗体(1∶1 000稀释)。4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗37℃孵育1 h，加入化学荧光发光底物反应5 min。X线片曝光，凝胶成像系统分析结果，重复3次。

1．2．6 Bad mRNA检测 采用Q-PCR法。收集各组细胞，加入Trizol溶液裂解细胞提取总RNA，检测样本纯度和完整性，逆转录后PCR扩增、电泳。设计Bad mRNA上游引物:5'-TATGTTCCCTCTCCGTTACT-3'，下游引物:5'-CTCCAGCTAGGATGATAGGA-3'。

1．2．7 统计学方法 采用SPSS13．0软件进行统计分析。计量资料以¯x±s表示，组间比较采用t检验;计数资料采用单因素方差分析，样本率的比较采用χ2检验。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 各组细胞存活率和凋亡率比较 见表1。

表1 各组细胞存活率和凋亡率比较(%，¯x±s)

2．2 各组细胞p-ERK1/2蛋白、Bad mRNA水平比较 见表2、图1。

表2 各组细胞p-ERK1/2和Bad mRNA水平比较(¯x±s)

图1 Western blot法检测各组细胞ERK1/2和p-ERK1/2水平

3 讨论

缺血后适应是指心肌持续缺血后，在长时间再灌注之前给予1次或数次短时间的缺血/再灌注。薛枫等［5］在临床工作中证实，急诊经皮冠状动脉介入治疗缺血后适应处理，能改善心肌灌注，减少心肌坏死;于宗良等［6］对家兔进行研究，得出相似结论。缺血后适应应用临床多年，表现出一定的细胞保护作用，但仍无法达到满意的效果。

CT-1在体内分布广泛，在多种组织器官内具有保护细胞的作用。研究证实，CT-1可保护胰腺β细胞，减少β细胞凋亡［7］;减少肝脏移植术后肝细胞的缺血/再灌注损伤［8］等。在心血管系统，CT-1被证实与心血管疾病的发生及发展密切相关，其在体外可激活CD+4T淋巴细胞，部分激活充血性心衰时的免疫应答［9］。高血压时CT-1表达上调，诱导血管平滑肌细胞增生、肥大，生产细胞外基质［10］。而且，CT-1可促进心肌细胞应对各种损伤，促进心肌细胞进行适应性改变，产生细胞保护作用。本研究发现，单独应用缺氧后适应虽可起到细胞保护作用，但效果有限，加入CT-1后心肌细胞存活率明显上升、凋亡率下降，提示缺氧后适应联合CT-1后细胞保护作用明显提高。

缺氧后适应及CT-1的心肌细胞保护作用机制尚未完全明确，而已有的研究表明，ERK1/2信号通路不仅与心肌细胞的分化［11］、肥大［12］、血管平滑肌细胞的增殖［13］有关，而且与各种心肌保护机制密切相关［14～16］。ERK1/2存在非磷酸化及磷酸化两种形式，p-ERK1/2具有生物学活性，可产生一系列生物学效应。本研究结果提示，缺氧后适应通过激活ERK1/2信号通路使ERK1/2磷酸化，进而下调Bad mRNA表达，减少心肌细胞凋亡，起到心肌保护作用。在缺氧后适应的基础上加入CT-1，p-ERK1/2蛋白表达量明显增加，提示缺氧后适应联合CT-1可进一步加强对ERK1/2信号通路的激活作用，从而增加ERK1/2磷酸化水平，产生更大的心肌细胞保护作用。

综上所述，缺氧复氧损伤对心肌细胞伤害较大，缺氧后适应处理可减少缺氧复氧对心肌细胞的损伤，与CT-1联合后可明显增强对缺氧复氧心肌细胞的保护作用，其可能的机制为通过激活ERK1/2信号通路，使ERK1/2蛋白磷酸化，下调Bad mRNA表达。

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［5］薛枫，杨向军，章斌，等．缺血后适应在急诊经皮冠状动脉介入治疗中的应用［J］．临床心血管病杂志，2011，27(5):341-345．

［6］于宗良，陈乐，杨向军．粒细胞集落刺激因子联合缺血后适应治疗急性心肌梗死的实验研究［J］．中国病理生理杂志，2012，28(11):1933-1937．

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