体外发酵产气技术在饲料营养价值评定中的作用

哈斯花 内蒙古农业大学 010020

20世纪初以来，由于体外产气法能够较好地模拟瘤胃中的发酵历程和预测体内物质消化率，引起了营养学家们的兴趣。我国用人工瘤胃法评定饲料营养价值已有将近20年的历史。丁角立（1983）首次将人工瘤胃产气法用于牛饲料营养价值的评定，并与体内消化相比较，获得了比较满意的结果。1985年金得哲等用人工瘤胃气法测定鹿常用饲料的营养价值，所测值与体内法相比较，与活体内、外的饲料有机物质消化率呈极强的正相关 （r2=0.9895）。王加启、冯仰廉（1995）在瘤胃持续模拟技术的基础上研究探索了持续发酵和收集气体的方法，并强调发酵产气的数量和组成是研究饲料特性的重要参数。另外，结果表明：体外产气量与体内的消化参数具有很高的相关性。此后，气体技术被确定为评价饲料营养价值的有效方法之一。

体外产气技术应用十分广泛，涉及到营养学、微生物学及环境科学等多个科学领域。现今主要的研究方向有：

（1）评定反刍动物饲料中的干物质降解率和代谢能。

（2）体外产气量与体内消化率具有显著的相关性，若考虑饲料中蛋白质对产气量的影响则能进一步提高对动物体内消化率的预测。

（3）预测动物的采食量两步法是Tilley和Terry于1963年在一步法的基础上提出的。该法以试管培养瘤胃液和饲料样品模拟瘤胃消化来评定饲料的可消化性，即将饲料在瘤胃液中培养48h后再用胃蛋白酶（pH大约为2）培养48h，模拟真胃和部分小肠的消化过程，培养结束后分离出残渣进行分析。两步法可以在体外模拟瘤胃消化，多应用于评定饲料中的干物质及有机物在瘤胃中的降解率。

体外发酵法是评定反刍动物饲料营养价值的一种非常有效的方法，可同时进行大量样本的测定。与体内法相比，此法不需要大量的实验动物，其结果与体内法具有高度相关性，已经越来越多地应用在反刍动物饲料的营养研究上。

1 材料与方法

1.1 实验材料

样品：全混日粮。

实验动物：内蒙古农牧业科学院提供的内蒙古白绒山羊4只。

实验地点：内蒙古农牧业科学院。

时间：2011.03-2011.05。

实验试剂：缓冲液、胃蛋白酶溶液、培养液、0.2M盐酸、工作液、A液、B液。

1.2 实验方法

带有永久性瘤胃瘘管的健康的内蒙古白绒山羊4只，用吸管法在瘤胃的不同部位采集瘤胃液。全混日粮每天饲喂2次，自由饮水，专人管理，预试期 7d。

表1：实验全混日粮

（1）常规分析实验

全混日粮1和全混日粮2的成分检测方法参照杨胜（1999）的《饲料分析及饲料质量检测技术》。NFC%=100-(NDF%+CP%+Fat%+Ash%)。

（2）产气量的测定

进行另一批3个重复的培养,将0.4g待测样品干物质置于特制的150mL酸奶瓶中,用60mL瘤胃稀释液(20mL瘤胃液+40mL培养液)消化。记录1h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、12h、24h、36h 及 48h 各时间点的产气量(具体记录时间视实际产气量而定)。采用Groot等(1996)描述的多相组合模拟模型gas(ml)=a1/(1+(k1/t))c1+……+an/(1+(kn/t))cn计算动态消化产气参数。式中∶a代表每一饲料组分理论上的最大产气量(mL)；k为对应饲料组分达到最大产气量一半时所需时间（h）；而c是决定曲线形状的参数；t为培养时间(h)。产气开始后，按照表3中的时间点记录产气量，每次记录后放气，使注射器的刻度归零，下一次记录完毕后又返回到零刻度。前几个小时内产气较多，记录时间稍密一些，以后间隔的时间稍长一些，可以减少试验误差。

（3）活体外pH和NH3-N发酵参数的测定

在39℃厌氧条件下,将0.2g待测样品干物质置于特制的150mL酸奶瓶中,用30mL瘤胃稀释液（10mL瘤胃液+20mL培养液）消化。每个培养设3个重复，待培养至24 h时立即测定发酵液的pH值，采用上海雷磁仪器厂PHS-3B型高精度酸度计测定。氨态氮含量的测定参照冯宗慈等（1993）提出的方法。

依次量取工作液0mL、1mL、2mL、4mL 和6mL，置于5个编号的50mL容量瓶内，依次加入蒸馏水 10mL、9mL、8mL、6mL、4mL 中， 使之成为10mL，再用0.2M盐酸定容至刻度处，此系列标准溶液中每100mL溶液的含氮量分别为0mg、0.2mg、0.4mg、0.8mg 和 1.2mg。

准确量取各标准溶液0.4mL，分别置于5个容量为10mL的试管内，各管内依次加入A液2mL和B液2mL，摇匀、静置10min后，用722分光光度计于波长700nm处比色，采用0.5cm的比色皿。用装有蒸馏水的0号试管作为空白对照，测定各溶液的消光值。用消光值作为自变量、溶液含N量作为从变量导出回归方程式。

取10mL瘤胃液于3500-4000r/min下离心10min，量取2mL上清液置于15mL试管内，加入8mL0.2M盐酸至10mL，摇匀，比色操作同上所述。把测得的消化值代入回归公式，计算得到的结果再乘以样品的稀释倍数即为原样品的氨氮含量。

（4）两级离体实验方法

首先在厌氧、39℃条件下,用瘤胃液的稀释液消化1.5g底物样品 （称取样品1.5g，放入培养瓶中，每管加入120mL的缓冲液混匀，通入CO2，直到其达到饱和状态。将其放入培养箱中，使其温度达到38℃，然后加入30mL瘤胃液，测定pH值并通入CO2，达到饱和，pH值应保持在6.7-6.9。利用1mol/L的NaCO3来加以调整），在培养箱中培养48h,每天摇动2-3次。在培养开始后6h和24h，测定内容物的pH值并加以适当的调整。然后加入1mL 5%HgCl2、2mL1moL/L 的 NaCO3来抑制微生物的活动，促进沉淀。离心，弃上清液。然后加入胃蛋白酶150mL，在39℃、酸性条件（pH应在1.5左右）下再消化48h。然而为了最大限度地体现底物中粗蛋白含量不同对底物活体外消化率的影响,在缓冲液的配制中不添加尿素。瘤胃液采自装有永久性瘤胃瘘管且饲喂饲粮的精粗比例为40∶60的内蒙古白绒山羊。培养结束后，测定残渣中的DM、CP和 NDF含量，计算得出 DMD、CPD和NDFD的含量。

2 结果与分析

2.1 常规分析结果

表2：全混日粮营养成分

从表2中两种不同配比的全混日粮的营养成分可以看出，全混日粮1的DM%、CP%和NFC%比全混日粮2的高，全混日粮1的NDF%、Ash% 、Fat%比全混日粮2的低。

2.2 产气量的测定结果

表3：0.4g底物体外发酵产气量的平均值

从表3中的结果可以看出，1-24h内全混日粮2的产气量大于全混日粮1的产气量，差距很明显；36-48h内全混日粮1的产气量大于全混日粮2的产气量，差距不明显。

图1：两种不同全混日粮对体外瘤胃微生物发酵产气量的动态变化影响

2.3 NH3-N和pH的测定结果

表4：NH3-N和pH的测定结果

从表4中的结果可以看出，全混日粮2的氨氮浓度大于全混日粮1的氨氮浓度，全混日粮1的pH值大于全混日粮2的pH值。

2.4 两级离体实验结果

图2：NH3-N标线

表5：两级离体实验结果

从表5中的结果可以看出，全混日粮2的DM%、Cp%、NDF%都比全混日粮1的高。

3 讨论

3.1 累计产气量

产气量是一个可以综合反映饲料可发酵程度的指标，表现出瘤胃微生物活动的总体趋势，是反映饲料蛋白价值的综合指标。瘤胃内的气体的主要来源是瘤胃微生物消耗可溶性碳水化合物和其他营养物质产生的低级脂肪酸、甲烷、氢气、二氧化碳等代谢产物。体外产气量在某种程度上可反映出反刍动物料在动物体内的降解特性。本实验结果显示，不同精粗比例的全混日粮1和2在48h处的累计产气量分别为86.52mL和81.02mL。从图1中可以看出：前12h内，全混日粮2的产气量大于全混日粮1的产气量，差距明显。24-48h内，全混日粮1的产气量大于全混日粮2的产气量，差距不太明显。这说明全混日粮2比全混日粮1容易被消化。

3.2 氨氮的含量

反刍动物瘤胃液氨氮是瘤胃氮代谢中外源蛋白和内源含氮物质降解的重要产物，同时也是瘤胃微生物合成菌体蛋白的原料。

本实验结果显示：由表4可知，两种不同精粗比例的全混日粮的平均氨氮含量为18.42 mol/(g.mL)和 22.27mol/(g.mL)，全混日粮 2的氨氮含量高于全混日粮1的氨氮含量，这可能与全混日粮1中的CP含量较低有关。两种全混日粮的氨氮浓度都在最佳浓度范围之内，因此这两种全混日粮都可以被反刍动物很好地利用。

3.3 pH值

pH值反映的是饲料发酵产生的总酸度，可以反映瘤胃的发酵水平。

实验结果表明（见表4），添加不同日粮的pH值在6.43-6.58之间变化，均处于正常生理范围（pH值5.5-7.5），不会影响瘤胃的发酵功能。添加不同组成的日粮会直接影响饲粮蛋白质在瘤胃内的降解水平。

3.4 DM、CP、NDF的降解率

从降解率（见表5）可以看出，动物需求最多的营养成分是粗蛋白，而且粗蛋白要比其他营养成分降解的更多。因此，饲料的粗蛋白质含量越高，消化率越高；粗纤维越多，则消化率越低。全混日粮中2号是比较合理的配料。国内外的一些研究也表明，不同的饲料精粗配比对反刍动物消化营养物质是有影响的，本实验所得结论也与这种说法相符合。从表5中可以看出，DM、CP、NCF的有效降解率均为2号全混日粮高，可能是因为这种比例更有益于微生物的生长，瘤胃微生物的活性更高，生长速度更快，从而提高了其消化营养物质的效率。

4 结论

本实验利用常规分析法、体外产气法和两级离体法研究了两种不同精粗比例的全混日粮的营养价值。瘤胃发酵体外模拟方法不受实验动物的限制，可以在常规实验室进行研究。瘤胃发酵体外模拟方法能正确地评估各种饲料的营养价值，并在生产实践中实现不同饲料的优势互补，充分发挥饲料间的正组合效应。

从表3和表5的结果可知，全混日粮的总产气量、氨氮的含量和pH值都比较接近。全混日粮2的DM、CP、NCF降解率均大于全混日粮1，全混日粮2的组合效应比全混日粮1好。两种不同比例全混日粮的降解率不同，其营养价值也不同。实验结果与体内法具有高度的相关性。总体来说，两种全混日粮均可以被反刍动物利用，而且利用体外产气法和两级离体法来评定反刍动物的饲料营养价值是可行的。

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