继发性甲状旁腺功能亢进患者血清对内皮细胞的影响及Klotho蛋白的保护作用

陈 铖 俞香宝 孙 彬 曾 鸣 赵秀芬 钱 军 刘 佳 邢昌赢 毛慧娟

·论 著·

继发性甲状旁腺功能亢进患者血清对内皮细胞的影响及Klotho蛋白的保护作用

陈 铖 俞香宝 孙 彬 曾 鸣 赵秀芬 钱 军 刘 佳 邢昌赢 毛慧娟

目的：观察继发性甲状旁腺功能亢进（SHPT）患者血清对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增生、凋亡、一氧化氮（NO）合成的影响，并探讨Klotho蛋白的保护作用及机制。 方法：分别收集15例健康人、10例不伴SHPT的CKD 5期患者、15例SHPT拟手术治疗的患者混合血清，体外培养HUVEC。以健康人血清为正常对照，观察SHPT患者血清、不伴SHPT的CKD 5期患者血清处理细胞24h后对细胞增生的影响（CCK-8），观察不同浓度、不同时间SHPT血清对HUVEC增生的影响。在10%SHPT血清环境下，以不同浓度Klotho蛋白干预24h，检测HUVEC增生、凋亡（流式细胞术）、NO合成（硝酸盐还原法）。加／不加PD98059［细胞外调节蛋白激酶（ERK）1／2抑制剂］，检测总ERK（t-ERK）、磷酸化ERK（p-ERK）（Western印迹法检测）。 结果：不伴SHPT的CKD 5期患者血清和SHPT患者血清均可抑制细胞增生，且SHPT血清对于细胞增生的抑制作用较不伴SHPT的CKD 5期患者血清显著（P＜0.05）。在一定浓度范围内（5%～20%），随着SHPT血清浓度增加，细胞增生受抑制（P＜0.05），呈现浓度依赖性。10%SHPT血清处理细胞6h、12h、24h，随着处理时间延长，细胞增生受抑制（P＜0.05），呈现时间依赖性。50～100 ng／ml Klotho蛋白干预可部分恢复10%SHPT血清处理后HUVEC的增生活力（P＜0.05）、抑制其凋亡，并上调p-ERK表达，且可被PD98059阻断。SHPT血清作用下，HUVEC中NO合成减少（P＜0.05），Klotho蛋白干预可促进NO合成（P＜0.05）。 结论：SHPT血清抑制HUVEC增生和NO合成。Klotho蛋白可部分拮抗SHPT血清对HUVEC增生的抑制作用，并促进NO合成，其促进HUVEC增生的机制可能与其抗凋亡作用及上调p-ERK有关。

继发性甲状旁腺功能亢进 人脐静脉内皮细胞 Klotho蛋白 凋亡 外调节蛋白激酶 一氧化氮

心血管疾病（CVD）是影响慢性肾脏病（CKD）患者预后的重要因素，CVD死亡率占CKD患者总死亡率的44%～51%，是导致这类患者死亡的首位原因。CKD患者是发生CVD的高危人群。据文献报告，透析患者CVD死亡率是同龄一般人群的30倍［1］，动脉粥样硬化是其最为常见的心血管并发症之一。血管内皮细胞裱衬于整个血管系统的内表面，参与维持血液正常流动状态，是形成心血管封闭管道系统的形态基础。内皮细胞功能异常在动脉粥样硬化的发生中起着重要作用。尿毒症患者体内积聚大量尿毒症毒素，导致患者血管内皮细胞功能异常［2］，加速CVD的发展。尿毒症伴继发性甲状旁腺功能亢进（SHPT）患者体内的甲状旁腺激素（PTH）水平比非SHPT尿毒症患者高出数倍乃至数十倍，高PTH可导致血压增高，促进高脂血症的发展，是导致终末期肾病（ESRD）患者动脉粥样硬化的重要因素［3］。最近有Meta分析报道，高PTH浓度和心血管事件的风险增加密切相关［4］。

Klotho基因是Kuro等［5］于1997年发现的与衰老有关的新基因，并用古希腊神话中纺织生命之线女神的名字命名。Klotho基因被敲除的小鼠（kl－／－小鼠）可出现类似人类衰老的各种表现，如寿命缩短、听力下降、不育症、动脉硬化、软组织钙化、皮肤萎缩、骨质疏松及肺气肿等［6－8］。Klotho在正常肾脏中高表达，随着肾小球滤过率下降，CKD患者Klotho基因、蛋白的表达明显下降［9］。研究发现，Klotho蛋白对血管紧张素Ⅱ及肿瘤坏死因子α诱导的血管内皮细胞损伤、功能障碍具有保护作用［10，11］。近来Yang等［12］报道Klotho蛋白可减轻尿毒症毒素吲哚酚诱导的血管内皮细胞功能障碍。尿毒症伴SHPT时，甲状旁腺对成纤维细胞生长因子23（FGF23）抑制PTH的作用产生抵抗，其原因和甲状旁腺细胞中 FGF23受体、Klotho明显减少有关［13］，由此推测，外周器官中Klotho下调和尿毒症的并发症密切相关，上调Klotho水平可能减轻尿毒症的并发症。本实验通过模拟SHPT患者内环境状态，研究SHPT患者血清环境下人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的增生和一氧化氮（NO）的合成，重组人Klotho蛋白的干预对HUVEC增生、凋亡、NO合成等作用的影响。

材料与方法

材料 HUVEC细胞株由南京医科大学第一附属医院中心实验室惠赠；完全培养基为RMIP1640培养基、10%胎牛血清、青霉素100 U／L、链霉素100 U／L（美国 Gibco）；重组人 Klotho蛋白（美国peprotech）、CCK-8检测试剂盒（碧云天）、PD98059［细胞外调节蛋白激酶（ERK）1／2抑制剂］（美国CST）、总ERK（t-ERK）、磷酸化ERK（p-ERK）一抗（美国CST）、GAPDH一抗（武汉博士德）、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗（北京中杉金桥）、膜联蛋白A5-绿色荧光素（Annexin V-FITC）细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基），人Klotho检测ELISA试剂盒（武汉优尔生）、NO检测试剂盒（南京建成）。无菌管收集15例严重SHPT拟行甲状旁腺全切加前臂移植术患者，其中男性8例、女性7例，平均年龄45.3± 9.7岁（28～59岁）；10例不伴SHPT的CKD 5期患者，其中男性6例、女性4例，平均年龄52.7±16.7岁（36～79岁）；15例健康志愿者，其中男性12例、女性3例，平均年龄41.4±19.5岁（24～71岁）。全血各10 m l，3 000 r／min离心10 min分离血清。分别混合SHPT患者、不伴SHPT的CKD 5期患者、健康志愿者血清，分装后－80℃保存备用，并将三组血清送至南京医科大学第一附属医院检验中心，全自动生化分析仪检测血清尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）、尿酸、钙、磷，化学发光法检测全段甲状旁腺激素（iPTH）；免疫比浊法检测C反应蛋白（CRP）。

方法

细胞培养 将HUVEC置于含10%胎牛血清的1640培养基中，于37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。贴壁生长至融合状态，用0.25%胰蛋白酶－0.53 mmol／L EDTA消化，选择生长状态良好的细胞进行传代。将HUVEC以104个／m l接种在6孔板或96孔板，细胞贴壁融合达70%～80%时，更换为无血清1640培养液同步化24h。每次实验均采用同一代细胞，不同批次细胞重复实验3次。

Klotho含量测定 利用双抗体夹心ELISA法测定健康人混合血清、SHPT患者混合血清、不伴SHPT的CKD 5期患者混合血清三组中Klotho含量。

细胞增生活力测定 将细胞随机分组，分别以含10%SHPT血清（SHPT组）、10%不伴SHPT的CKD 5期患者血清（非SHPT组）及相应体积分数健康人血清（健康对照组）的1640培养基处理24h后，96孔板中每孔加入CCK-8 20μl，于37℃、5%CO2及饱和湿度条件下继续孵育4h，酶标仪450 nm波长处测定各孔的吸光度（OD值），检测细胞增生活力。

不同浓度SHPT血清下细胞增生活力测定 将细胞随机分组，分别以含不同体积分数（5%、10%、20%）SHPT血清（SHPT组）或相应体积分数健康人血清（健康对照组）的1640培养基处理24h，CCK-8检测细胞增生活力。

10%SHPT血清下不同时间点细胞增生活力测定 将细胞随机分组，分别以含10%SHPT血清或10%健康人血清的1640培养基处理6h、12h、24h，CCK-8检测细胞增生活力。

10%SHPT血清处理细胞24h，不同浓度Klotho蛋白干预后细胞增生活力测定 将细胞随机分组，健康对照组 （含10%健康者血清）、SHPT组（含10%SHPT血清）、不同浓度Klotho干预组（Klotho蛋白25 ng／ml、50 ng／ml、100 ng／ml，分别加入含10%SHPT血清的培养基中），干预24h，CCK-8检测细胞增生活力。

有或无Klotho、PD98059干预下，10%SHPT血清处理24h后细胞增生活力测定 将细胞随机分组：健康人对照组 （含10%健康者血清）、SHPT组（含10%SHPT血清）、不同浓度Klotho干预组（Klotho蛋白50、100 ng／ml，分别加入含有10%SHPT血清的培养基中）、不同浓度Klotho＋PD98059组（Klotho蛋白50 ng／ml＋PD980569 10μmol／L、Klotho蛋白 100 ng／ml＋PD98059 10μmol／L，分别加入含有10% SHPT血清的培养基中），干预24 h，倒置显微镜观察各组细胞形态、CCK-8检测细胞增生活力。

有或无Klotho、PD98059干预下，10%SHPT血清处理24h后细胞凋亡测定 细胞分组同增生活力测定，干预24h，0.25%胰酶（无EDTA）消化并收集细胞，PBS洗涤，AnnexinⅤ／碘化丙啶（PI）染色后流式细胞术检测细胞凋亡。

有或无Klotho、PD98059干预下，10%SHPT血清处理24h后免疫印迹法测定细胞t-ERK、p-ERK表达 细胞分组同增生活力测定，干预24 h，提取细胞蛋白，每组取已煮沸变性蛋白50μg，10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，100V×1h湿法转移至硝酸纤维素膜。转载标本蛋白的硝酸纤维素膜浸入含5%脱脂奶粉的TBST中室温封闭1h，加入一抗，4℃孵育过夜，TBST洗涤15 min×3次后，加入HRP标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗，室温孵育1h，充分洗涤后，利用BIO-RAD自动曝光机曝光，Image J图像分析软件进行条带的分析。

有或无Klotho干预下，10%SHPT血清处理24h后，硝酸盐还原法测定NO生成量 将细胞随机分组：10%健康对照组、10%SHPT组、Klotho干预组（Klotho蛋白50 ng／ml、100 ng／ml，分别加入含10% SHPT血清的培养基中），处理HUVEC 24h，收集6孔板中每组上清液。取等量的蒸馏水、20μmol／L亚硝酸钠溶液、细胞上清液，分别配置成空白管、标准管、测定管，15 min后550 nm处测定各管0D值，并根据说明书所提供的公式：NO含量（μmol／L）＝（测定管OD值－空白管OD值）／（标准管OD值－空白管OD值）×标准品浓度（20μmol／L），计算NO含量。

统计学分析 实验数据用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

三组血清实验室检查主要成分比较 健康人混合血清、SHPT患者混合血清、不伴SHPT的CKD 5期患者混合血清主要成分见表1，SHPT混合血清中BUN、SCr、尿酸、钙、磷、iPTH、CRP等明显高于健康人混合血清，iPTH明显高于不伴SHPT的CKD 5期患者混合血清（表1）。

表1 三组血清主要成分比较

三组血清Klotho含量的比较 健康人混合血清、SHPT患者混合血清、不伴SHPT的CKD 5期患者混合血清中Klotho蛋白分别为1 264.1±192.3 pg／m l、458.5±57.3 pg／m l、438.4±55.2 pg／m l。健康人混合血清与后两者血清比较，差异有统计学意义（P＜0.001）。但SHPT混合血清和不伴SHPT的CKD 5期患者混合血清比较，无统计学差异（P＝0.775）（图1）。

图1 三种混合血清中K lotho蛋白水平比较

细胞形态学改变 倒置显微镜观察发现，处理24h后，10%健康人血清组HUVEC生长致密，呈多角形，如铺路石状，胞体上凸起向四周伸展。而10% SHPT血清组HUVEC数量减少，细胞皱缩、核固缩、边缘化、细胞质浓缩。Klotho干预组（Klotho蛋白50 ng／ml、100 ng／ml，分别加入含10%SHPT患者血清的培养基中）较SHPT组HUVEC数量增多，细胞形态接近正常。Klotho＋PD98059组（Klotho蛋白50 ng／ml＋PD980569 10μmol／L、Klotho蛋白 100 ng／ml＋PD98059 10μmol／L，分别加入含10%SHPT血清的培养基中）HUVEC数量减少，细胞皱缩（图2）。

细胞增生活力比较

10%健康人血清、10%SHPT血清、10%不伴SHPT的CKD 5期患者血清处理细胞24h，细胞增生活力测定 和健康对照组比较（OD值2.478± 0.094），SHPT血清组（OD值1.363±0.023）、不伴SHPT的CKD 5期患者血清组（非SHPT组）（OD值1.498±0.027）的细胞增生活力明显降低（健康对照组vs SHPT组，P＜0.001；健康对照组vs非SHPT组，P＜0.001），且SHPT血清对于细胞增生抑制作用较不伴SHPT的CKD 5期血清显著（P＝0.029）（图3）。

不同浓度的SHPT血清作用24h对HUVEC增生活力的影响 随着 SHPT血清浓度的增加，HUVEC增值活力降低，5%、10%、20%SHPT血清组OD值分别是 1.934±0.088、1.570±0.160、1.282±0.150（5%SHPT血清组vs 10%SHPT血清组，P＝0.004；5%SHPT血清组vs 20%SHPT血清组，P＜0.001；10%SHPT血清组vs 20%SHPT血清组，P＝0.014）。并且和相应浓度健康对照组比较（5%、10%、20% 健康对照组OD值分别是2.392± 0.074、2.487±0.100、2.592±0.139），SHPT血清处理组细胞增生活力明显降低（5%SHPT血清组vs 5%健康对照组，P＝0.001；10%、20%SHPT血清组vs相应健康对照组，P＜0.001）（图4）。

图2 10%健康人或SHPT血清处理 24h，有或无K lotho蛋白、PD98059干预下细胞形态（倒置显微镜，×200）

图3 10%健康人血清、10%SHPT血清、10%不伴SHPT的CKD 5期患者血清处理细胞24h，细胞增生活力测定

图4 不同浓度SHPT血清及健康人血清处理24h细胞增生活力

10%SHPT血清作用6h、12h、24h后对HUVEC增生活力的影响 随着SHPT血清作用时间的延长，HUVEC增值活力下降，10%SHPT血清作用6h、12h、24h OD值分别是1.767±0.062、1.599±0.018、1.353±0.026（6h组vs12h组，P＝0.001；6h组vs24h组，P＜0.001；12h组vs24h组，P＜0.001），三组间比较差异有统计学意义。并且和同时间点健康对照组相比（10%健康人血清作用6h、12h、24h OD值分别是2.146±0.027、2.373±0.081、2.608±0.047）差异有统计学意义（图5）。

10%SHPT血清处理细胞24h，不同浓度Klotho蛋白干预后内皮细胞增生活力测定 与SHPT组（OD值1.598±0.078）比较，50 ng／m l Klotho干预组（OD值1.869±0.118）、100 ng／ml Klotho干预组（OD值2.021±0.123）可增加细胞增生活力（SHPT组vs50 ng／ml Klotho组，P＝0.01；SHPT组vs 100 ng／ml Klotho组，P＝0.001），差异有统计学意义。而25 ng／ml Klotho干预组（OD值1.645±0.114）与SHPT组比较，差异无统计学意义（P＝0.596）（图6）。

10%SHPT血清或健康人血清作用24h，不同浓度Klotho蛋白干预后对HUVEC增生活力的影响与健康对照组（OD值2.305±0.255）相比，SHPT组HUVEC增生活力明显下降（OD值1.707±0.113）（P＜0.001）。加入Klotho蛋白的干预组其增生活力部分恢复，50 ng／ml Klotho＋SHPT血清组OD值1.991±0.121（P＝0.043）；100 ng／ml Klotho＋SHPT血清组OD值2.117±0.136（P＝0.007），且可被PD98059抑制阻断，50 ng／ml Klotho＋SHPT血清 ＋PD98059组 OD值1.656±0.129（50 ng／ml Klotho＋SHPT血清组vs 50 ng／ml Klotho＋SHPT血清＋PD98059组，P＝0.021）；100 ng／ml Klotho＋SHPT血清＋PD98059组OD值1.681±0.117（100 ng／ml Klotho＋SHPT血清组vs 100 ng／ml Klotho＋ SHPT血清＋PD98059组，P＝0.005），差异有统计学意义（图7）。

图5 10%SHPT或健康人血清处理6h、12h、24h细胞增生活力

图6 10%SHPT血清处理细胞24h，不同浓度k lotho蛋白干预，细胞增生活力测定

图7 10%健康人或SHPT血清处理24h，不同浓度K lotho蛋白加或不加PD98059对HUVEC增生活力的影响

10%SHPT血清或健康人血清作用24h，不同浓度Klotho蛋白干预后对HUVEC凋亡的影响 相比健康对照组，SHPT血清可诱导HUVEC凋亡，健康对照组细胞凋亡率（3.21±0.59）%，SHPT组凋亡率8.53% ±0.81%，两组比较差异有统计学意义（P＜0.001）。Klotho蛋白干预后，细胞凋亡减少，50 ng／ml Klotho＋SHPT血清组凋亡率6.14%± 0.86%、100 ng／ml Klotho＋SHPT血清组凋亡率5.86%±0.98%（50 ng／ml Klotho干预组vs SHPT组，P＝0.001；100 ng／ml Klotho干预组vs SHPT组，P＝0.001）。并且PD98059可阻断Klotho蛋白的抗凋亡作用，50 ng／ml Klotho＋SHPT血清＋PD98059组凋亡率8.12%±1.03%、100 ng／ml Klotho＋SHPT血清 ＋PD98059组凋亡率7.87% ±0.65%。（50 ng／ml Klotho＋SHPT血清＋PD98059组vs50 ng／ml Klotho＋SHPT血清组，P＝0.006；100 ng／ml Klotho＋SHPT血清＋PD98059组vs 100 ng／ml Klotho＋SHPT血清组，P＝0.005）（图8）。

图8 10%SHPT血清或健康人血清作用24h，不同浓度K lotho蛋白干预，对HUVEC凋亡的影响

10%SHPT血清作用24h，不同浓度Klotho蛋白干预后对细胞t-ERK、p-ERK表达的影响 与SHPT血清组比较，Klotho蛋白干预对t-ERK表达无影响，但可明显上调p-ERK表达，并可被PD98059所抑制（图9）。

10%SHPT血清作用24h，不同浓度klotho蛋白干预后对HUVEC合成NO的影响 与10%健康人血清组相比（149.50±10.16μmol／L），SHPT血清干预24h后细胞NO合成明显减少（99.94±16.28 μmol／L），Klotho干预组 NO合成增加（50 ng／ml Klotho＋SHPT血清组 NO合成量111.35±13.33 μmol／L，100 ng／ml Klotho＋SHPT血清组NO合成量139.78±15.89μmol／L）。其中健康对照组、100 ng／ml Klotho＋SHPT血清组与SHPT组相比，组间比较差异有统计学意义（健康对照组vs SHPT组，P＝0.03；100 ng／ml Klotho＋SHPT血清组vs SHPT组，P＝0.039）（图10）。

讨 论

1974年，Linder等［14］提出“加速性动脉粥样硬化”概念，并指出加速性动脉粥样硬化是影响维持性血液透析患者长期生存的主要危险因素，尿毒症时机体出现特殊的病理生理状态，导致血管内皮细胞功能障碍［2］。与不伴SHPT的尿毒症患者相比，伴SHPT尿毒症患者体内不仅存在尿素、肌酐、吲哚酚、胍类、胺类等多种毒素，且其体内PTH水平也高出正常水平的数倍甚至于几十倍。血 PTH＞70 pg／ml时，即可成为CKD 3～4期患者CVD的独立危险因素［15］。过高的PTH是加重血管内皮损害的另一危险因素，对这部分患者而言，其心血管病变更是雪上加霜，有效延缓 SHPT患者的 CVD进展是SHPT治疗的重点之一。有效防治加速性动脉粥样硬化降低心脑血管事件的发病率和死亡率，能改善SHPT患者的预后。动脉粥样硬化是多种病因造成的动脉壁内膜的一系列复杂的分子和细胞改变，始发于内皮细胞损伤。血管内皮损伤与功能失调是动脉粥样硬化形成的关键环节。SHPT患者动脉粥样硬化的危险因素既有高血脂、吸烟、糖尿病、高血压等传统危险因素，也有钙磷代谢紊乱、高PTH血症、氧化应激、微炎症、高同型半胱氨酸血症、各种晚期糖基化产物（AGEs）和晚期氧化蛋白产物（AOPPs）等尿毒症毒素的大量出现、免疫功能紊乱等非传统因素，它们能诱导细胞功能失调，参与并促进动脉粥样硬化形成。内皮细胞作为血管内皮基本的结构和功能单位，它的一个重要功能就是发挥屏障功能，调节血管内外的物质交换。受损血管内皮的修复主要依靠邻近的正常细胞迁移增生来修复［16］，因此内皮细胞生长增生与内皮的修复和动脉粥样硬化的发生密切相关。本研究发现，相比正常健康人血清，SHPT血清、不伴SHPT的CKD 5期患者血清均可抑制HUVEC细胞增生，且SHPT血清对于细胞增生的抑制作用较不伴SHPT的CKD5期患者血清更为显著，提示伴SHPT更明显加速动脉粥样硬化的发生。

图9 10%SHPT及健康人血清作用24h，不同浓度K lotho蛋白加或不加PD98059，对内皮细胞ERK表达的影响

近年来，在衰老及衰老相关疾病中具有关键作用的Klotho基因和蛋白日益受到关注。人Klotho蛋白有膜型、分泌型两种形式，Klotho蛋白可作为激素因子，对氧化应激所致的血管内皮细胞损伤具有保护作用。在一侧肾皮质电烙术加对侧肾全切术诱导的载脂蛋白E基因敲除小鼠尿毒症模型中发现，Klotho基因及蛋白的表达与动脉粥样硬化的进程呈负相关［17］，Klotho下调可能参与了尿毒症动脉粥样硬化过程［18］。值得注意的是，最近有学者提出尿毒症本身就是失控的加速衰老过程，抗衰老治疗可能是新的思路［19］。本研究模拟SHPT血清环境，体外观察发现，Klotho蛋白可部分恢复SHPT血清作用下HUVEC的增生活力、并抑制其凋亡，提示Klotho蛋白可部分拮抗 SHPT血清的致动脉粥样硬化作用。

图10 10%SHPT或健康人血清处理24h，加或不加不同浓度K lotho蛋白，对内皮细胞合成NO的影响

NO是目前已知最重要的内皮细胞衍生的血管舒张因子之一，是一种细胞信使分子，除血管扩张作用外，NO还对血管有多种作用，包括维持血管弹性，抑制由二磷酸腺苷诱导的血小板聚集并有效解聚血小板，抑制淋巴细胞、粒细胞和单核细胞黏附于血管内皮等。这些作用使NO成为一种重要的防护动脉粥样硬化形成的因素。内皮细胞NO合成水平的变化必然会影响血管的正常防护机制，导致血管的结构和功能异常。本研究发现，SHPT血清抑制HUVEC合成NO，而Klotho蛋白则可促进其合成，提示Klotho蛋白通过对NO合成的影响保护血管内皮。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路是生物体内重要的信号转导系统之一［20］，其中ERK1／2信号转导通路属于MAPK家族，它在细胞生长、细胞周期、应激、凋亡等多种生理和病理过程中起重要作用，调节细胞增生分化和细胞骨架重排等生物学行为，p-ERK是ERK信号通路中的重要激活形式，参与细胞的基因表达、迁移、分化、和增生调控作用。本研究发现，Klotho蛋白部分恢复SHPT血清作用下HUVEC的增生活力、抑制其凋亡，同时伴p-ERK表达的上调，且可被PD98059所阻断。提示ERK信号通路参与了Klotho蛋白的血管保护作用。本研究的实验结果显示Klotho蛋白对内皮细胞有保护作用，是尿毒症伴SHPT状态下动脉粥样硬化的潜在治疗因子，值得进一步深入研究。

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Effect of serum from secondary hyperparathyroidism patients on the endothelial cells，and the intervention of K lotho

CHEN Cheng，YU Xiangbao，SUN Bin，ZENGMing，ZHAO Xiufen，QIAN Jun，LIU Jia，XING Changying，MAO Huijuan Department ofNephrology，The First Affiliated Hospital ofNanjing Medical University，Nanjing 210029，China

MAO Huijuan（E-mail：huijuanmao＠126．com）

Objective：To investigate the effect of secondary hyperparathyroidism（SHPT）patients'serum on the endothelial cells and to explore the protection of Klotho and its possiblemechanisms in this process. M ethodology：Three types ofmixed serum from fifteen patients with SHPT scheduled for parathyroidectomy，10 CKD patients at stage 5 without SHPT and 15 healthy volunteerswere collected.Human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）were incubated in vitro with SHPT serum or serum of stage 5 CKD patientswithout SHPT or healthy serum as control.First，the effects of the above three types serum on the proliferation of HUVEC after 24h treatment（CCK-8）were compared.Second，HUVECs were divided into 3 groups：control group（10%healthy serum medium），SHPT group and Klotho treatment group（SHPT serum and Klotho）.The proliferation and apoptosis of endothelial cellswere evaluated respectively by CCK-8 and Flow Cytometry. The synthesis of NO wasmeasured by nitrate reduction method.The levels of extracellular signal-regulated kinase（ERK1／2）and phosphorylated forms of ERK1／2（p-ERK1／2）were detected by Western blotting（with or without ERK inhibitor PD98059）. Results：The proliferation of HUVECwere both inhibited by the serum of SHPT patients and CKD-5 patients without SHPT，and the inhibition of SHPT serum was greater than that of the other（P＜0.05）.With the increase of concentration in a certain range（5%～20%），the proliferation of HUVECwas inhibited by SHPT serum in a concentrationdependentmanner（P＜0.05）.Compared with HUVEC incubated with SHPT serum for 6h，12h，the proliferation of HUVEC was significantly decreased when incubated for 24h（P＜0.05）.The proliferation was partly restored and the apoptosiswas inhibited when added 50 ng／m l～100 ng／ml of Klotho into 10%SHPT serum（P＜0.05）.In themeantime，p-ERK was also upregulated and could be inhibited by PD98059.The synthesis of NO was decreased in SHPT group（P＜0.05）and increased in the treatment of Klotho（P＜0.05）. Conclusion：The proliferation of HUVEC was inhibited by the serum of SHPT patients，which could be partly antagonized by Klotho.The NO synthesis of the endothelial cells in the SHPT serum was also increased by klotho.The promotion of HUVEC proliferation by Klothomightbe due to the inhibition of HUVEC apoptosis and upregulation of p-ERK.

secondary hyperparathyroidism human umbilical vein endothelial cell klotho protein apoptosis extracellura regulated protein kinases nitric oxide

2013-07-23

（本文编辑 春 江 青 松）

江苏省卫生厅项目（Z201002）

南京医科大学第一附属医院肾内科（南京，210029）

毛慧娟（E-mail：huijuanmao＠126.com）

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