重组人生长激素对人乳腺癌细胞生长的影响及机制的研究

张晓娟，栗红蕊，崔 岩，王守俊

重组人生长激素 (r-hGH)作为外源性生长激素已广泛应用于临床，大量研究表明r-hGH在增强蛋白质合成代谢、克服手术和化疗引起的免疫功能下降、加速创口愈合及减少并发症等方面有重要临床意义。r-hGH是否会促进恶性肿瘤细胞生长已引起临床注意。本研究选用雌激素受体阳性 (ER+)的MCF-7人乳腺癌细胞株和雌激素受体阴性 (ER-)的MDA-MB-231人乳腺癌细胞株进行体外培养，以探讨r-hGH对不同类型人乳腺癌细胞生长的影响及可能涉及的信号通路，为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验用品及化学试剂 人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。r-hGH(SAIZEN)购自瑞士Serono公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)，蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(ser473)、细胞外信号调节蛋白激酶1/2(Erk1/2)、磷酸化Erk1/2抗体，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG及辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG均购自上海碧云天生物技术公司。

1.2 细胞培养 人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞培养于含10%小牛血清、1×105U/L青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基中，在37℃、5%CO2湿润的环境中培养。

1.3 MTT法测细胞增殖 取对数生长期的MCF-7和MDAMB-231细胞调整细胞浓度为4×104/ml，接种于96孔板中，待细胞贴壁后，行以下处理: (1)以500、1 000、2 000、4 000 μg/L r-hGH作用 48 h;(2)以 4 000 μg/L r-hGH 作用24、48、72、96 h，每组设6个复孔，以上均设未处理对照组。每孔加入 MTT液 (5 mg/ml)20 μl，振荡后继续于37℃、5%CO2环境中孵育4 h，吸去上清液，每孔加入二甲基亚砜 (DMSO)200 μl，振荡5 min，用酶标仪在490 nm波长处测定各孔的吸光度 (A值)。实验重复3次。

1.4 流式细胞仪测细胞周期 细胞以1×105个/孔接种于6孔板，贴壁48 h，用4 000 μg/L r-hGH作用于细胞，设立阴性对照组。培养48 h，收集细胞，磷酸盐缓冲液 (PBS)洗涤2次，离心后的细胞沉淀用70%乙醇2 ml重悬，4℃过夜，50 g/L碘化并啶 (PI)染液染色，4℃避光30 min，流式细胞仪检测细胞周期。

1.5 Western blot检测Erk1/2、Akt的表达 细胞以8×104个/孔接种于6孔板，贴壁48 h，4 000 μg/L r-hGH作用48 h，设立对照组，提取细胞总蛋白;BCA法测定蛋白浓度;SDSPAGE胶上每泳道上样100 μg蛋白，进行电泳，转膜，封闭，一抗 (1∶600)摇床4℃孵育过夜，TBST洗膜5 min×3，加HRP标记的二抗 (1∶1 000)孵育1 h，洗涤后DAB显色。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，计量资料以 (x±s)表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度r-hGH对MCF-7和MDA-MB-231细胞生长的影响 与对照组相比，以500、1 000、2 000、4 000 μg/L的r-hGH作用48 h后MCF-7细胞和MDA-MB-231增殖不明显，差异无统计学意义 (F值分别为3.156和2.321，P值分别为0.968和0.823，见图1、2)。

2.2 不同作用时间r-hGH对MCF-7和MDA-MB-231细胞生长影响 与对照组相比，以4 000 μg/L r-hGH作用24、48、72、96 h后MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞增殖不明显，差异无统计学意义 (F值分别为19.032和1.982，P值分别为0.321和0.076，见图3、4)。

图1 不同浓度r-hGH对MCF-7细胞增殖的影响 (n=12)Figure 1 Comparison of absorbance in MCF-7 cells with different concentration of r-hGH

图2 不同浓度r-hGH对MDA-MB-231细胞增殖的影响(n=12)Figure 2 Comparison of absorbance in MDA-MB-231 cells with different concentration of r-hGH

图3 4 000 μg/L r-hGH作用不同时间时MCF-7细胞A值的比较(n=12)Figure 3 Comparison of absorbance in MCF-7 cells with different time of r-hGH

图4 4 000 μg/L r-hGH作用不同时间时MDA-MB-231细胞A值的比较 (n=12)Figure 4 Comparison of absorbance in MDA-MB-231 cells with different time of r-hGH

2.3 流式细胞术测定r-hGH对MCF-7和MDA-MB-231细胞周期的影响 以4 000 μg/L r-hGH作用MCF-7和MDA-MB-231细胞48 h后，两组各期细胞间差异均无统计学意义 (P＞0.05，见表1、2)。

2.4 Western blot法测定胰岛素作用MCF-7细胞48 h Erk1/2和Akt表达情况 以4 000 μg/L r-hGH作用MCF-7和MDA-MB-231细胞48 h后，Erk1/2和Akt磷酸化程度与对照组比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05，见表3、4，图5、6)。

表1 以4 000 μg/L r-hGH作用MCF-7细胞48 h后两组细胞周期结果(x ±s，%)Table 1 Effect of r-hGH on cell cycle of MCF-7 cells between two groups

表2 以4 000 μg/L r-hGH作用MDA-MB-231细胞48 h后两组细胞周期结果 (x ±s，%)Table 2 Effect of r-hGH on cell cycle of MDA-MB-231 cells between two groups

表3 r-hGH作用MCF-7细胞后两组Erk1/2和Akt磷酸化程度比较(x ±s，%)Table 3 Phosphorylation of Erk1/2 and Akt of MCF-7 cells after treated with r-hGH

表4 r-hGH作用MDA-MB-231细胞后Erk1/2和Akt磷酸化程度比较(x ±s，%)Table 4 Phosphorylation of Erk1/2 and Akt of MDA-MB-231 cells after treated with r-hGH

图5 r-hGH作用MCF-7细胞后Erk1/2和Akt及其磷酸化蛋白的表达Figure 5 Expression of Akt，P-Akt，Erk1/2 and P-Erk1/2 in MCF-7 cells after treated with r-hGH

图6 r-hGH作用MDA-MB-231细胞后Erk1/2和Akt及其磷酸化蛋白的表达Figure 6 Expression of Akt，P-Akt，Erk1/2 and P-Erk1/2 in MDAMB-231 cells after treated with r-hGH

3 讨论

有研究表明，r-hGH可以通过作用于肝脏细胞膜上生长激素受体 (GHR)产生生长介素如胰岛素样生长因子-1(IGF-1)而促进全身组织细胞的生长和增殖［1-2］，而生长激素的生物效应绝大部分是通过IGF1介导发挥的，Mathews等［3］发现许多组织细胞内 (如骨骼系统、中枢神经系统、胃肠道、肝脏、肾脏等)有GHR的存在或GHR mRNA的表达。r-hGH是否会促进肿瘤生长、复发和转移，一直是国内外学者关注的问题。大量研究证实，IGF-1与受体结合后通过丝裂原激活蛋白激酶 (MAPK)途径和磷脂酰肌醇3激酶(P13K)途径促进细胞的增殖、存活及迁移，并抑制细胞凋亡［4］。对肿瘤细胞而言，IGF-1是很强的丝裂原，介导GH的促生长作用，与人体多种肿瘤的发生有一定关系［5-6］。

由于乳腺癌死亡者占女性肿瘤死亡的14%［7］，严重威胁女性的健康和生命。乳腺癌患者能否应用外源性GH，延缓机体总蛋白的丢失，改善营养，增进免疫功能，减少病死率?为了观察r-hGH对乳腺癌细胞增殖的影响，考虑不同类型的乳腺癌细胞中GHR或IGF-1R表达不同［8］，可能会使r-hGH对其生长的影响也不同，本实验选用ER+的MCF-7人乳腺癌细胞株和ER-的MDA-MB-231人乳腺癌细胞株，采用r-hGH以不同浓度和时间作用于两种细胞，以500、1 000、2 000、4 000 μg/L r-hGH 作用 48 h 或 4 000 μg/L r-hGH 作用24、48、72、96 h后，两种细胞的增殖程度间无明显差异;为了进一步提高结果的可靠性，以4 000 μg/L r-hGH作用48 h，用流式细胞仪检测发现细胞周期变化较对照组无明显差异;接着对Erk1/2和Akt磷酸化程度检测，发现两种细胞中r-hGH组Erk1/2和Akt磷酸化程度较对照组无明显差异，提示IGF-1R和GHR下游的MAPK/ERK、PI3K/Akt信号通路未被激活。

本研究证实r-hGH在体外无促进乳腺癌细胞生长的作用，Erk1/2和Akt的磷酸化程度无明显升高;同时廖清华等［9］报道r-hGH能增强5-氟脲嘧啶对人乳腺癌细胞的化疗效果。这些均为肿瘤患者术后应用r-hGH进行代谢调理和改善不能手术的中晚期肿瘤患者的恶病质及降低化疗毒副作用提供了一定的实验依据。但由于本实验为体外细胞实验，可能在GHR的分布、IGF-1的多因素调节、癌细胞生长环境等方面与体内存在差别。因此，需要体内实验即动物模型进行进一步验证。

1 苏成安.重组人生长激素治疗青春期前特发性矮小症50例疗效分析［J］.海南医学院学报，2010，16(8):1051-1053.

2 段艳峰.河南安阳地区重组人生长激素治疗少年儿童特发性矮小症疗效分析［J］.中国全科医学，2011，14(11):3857.

3 Mathews LS，Enbery B，Norstedt G.Regulation of rat growth hormone gene expression［J］ .J Biol Chem，1989，264(17):9905-9910.

4 彭珊璐，冯国祝，王国香，等.新生儿缺氧缺血性脑病血清胰岛素样生长因子-1测定的意义［J］.实用心脑肺血管病杂志，2012，20(4):601.

5 Favoni RE，De-Cupis A，Ravera F，et al.Expression and function of the insulin-like growth factor-1 system in human non-small cell lung cancer and normal lung cell lines ［J］ .Int J Cancer，1994，56(6):858-866.

6 李旭，姚智.不同类型脑肿瘤患者血清胰岛素样生长因子-Ⅰ检测的临床意义 ［J］.中国全科医学，2011，14(8):2687.

7 Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(2):3322.

8 Bartucci M，Morelli C，Mauro L，et al.Differential insulin-like growth factor 1 receptor signaling and function in estrogen receptor-positive MCF-7 and ER-negative MDA-MB-231 breast cancer cells［J］ .Cancer Res，2001，61(18):6747-6754.

9 廖清华，吴向华，陆云飞，等.重组人生长激素与5-FU联合应用对人乳腺癌细胞株MCF-7细胞周期作用的实验研究［J］.广西医科大学学报，2006，28(4):492-495.