复方马钱子的抗肿瘤作用探讨

刘迎辉，林海红，杜钢军

（河南大学药学院 药物研究所，河南 开封 475004）

化疗在肿瘤治疗中一直占重要地位，而化疗对机体自身的毒性和肿瘤耐药是化疗失败的主要原因［1］。中药可作用于肿瘤发生、发展的多个环节，在改善肿瘤患者体质、降低化疗药物毒性、增强化疗药物的疗效方面独具特色［2］。

马钱子以番木鳖之名始载于《本草纲目》，为辛温大毒之品，具有通络止痛、散结消肿之功效［3］。药理实验［4］证明，马钱子有较好的抗炎、镇痛、免疫调节、抗血栓、抗心律失常等作用。复方马钱子是一种复方中药，其中的有效成分能对抗马钱子中士的宁的惊厥作用，提高疗效，改善患者的生活质量。

实验采用小鼠H22肝癌皮下移植肿瘤模型，研究复方马钱子的抗肿瘤作用。

1 实验材料

1.1 动物与瘤株

C57BL／6小鼠和昆明鼠，体质量18～25g，河南省医学实验动物中心提供；HCT－116 大肠癌细胞、H22肝癌细胞，由本实验室传代保存。

1.2 药品与试剂

RPMI 1640培养基、MTT、胎牛血清（Sigma公司）；青霉素和链霉素（华北制药集团公司产品）；Na＋检测试剂盒、K＋检测试剂盒、Cl－检测试剂盒、葡萄糖检测试剂盒（上海荣盛生物药业有限公司）。

1.3 复方马钱子的制备

取10g复方马钱子药粉，用含体积分数为52%乙醇的高粱酒500mL浸泡1周，过滤得到药酒。加热挥发酒精至100mL，加蒸馏水重新至500mL用于实验。

1.4 仪器

ELX 800UV型酶标仪（美国Bio－Tek公司）；SB－3C－1A型洁净工作台（100级洁净等级，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；XD－1014 倒置生物显微镜（南京江南光电集团股份有限公司）；CO2培养箱（NAPCO 公司）。

2 实验方法

2.1 复方马钱子对荷瘤小鼠体质量、肿瘤及免疫器官的影响

取生长良好的荷H22肝癌的昆明鼠处死，抽取其腹水，加无菌生理盐水稀释10倍，于小鼠前肢右腋皮下接种0.2mL／只，建立肝癌模型［5］。随机分为2组，每组10 只。对照组：口服灌胃生理盐水0.2mL／10g；给药组：口服灌胃复方马钱子提取液0.2mL／10g。肿瘤接种后当日开始给药，给药1次／d，疗程13d。治疗后1次／d测量小鼠体质量，待肿瘤长出后用游标卡尺隔天测肿瘤直径1次，肿瘤大小按下列公式计算。

肿瘤体积（mm3）＝肿瘤长度×肿瘤宽度×肿瘤宽度／2。

全程治疗结束后，次日处死小鼠，剥离腋部肿瘤、脾脏、胸腺并称重，计算肿瘤抑制率及脏器指数。

抑瘤率＝（1－T／C）×100%。式中：C为对照组平均瘤重（g）；T为实验组平均瘤重（g）。

脏器指数＝内脏器官质量（mg）／体质量（g）。

2.2 复方马钱子对小鼠淋巴细胞增殖的影响［6］

将C57BL／6小鼠脱颈处死，无菌取出脾脏，置平皿中，加D－Hank，s 液，将其研磨成细胞匀浆。以Tris－NH4Cl溶液溶解红细胞后，用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640培养液（内含青霉素和链霉素各100U／mL）调成2×106个／mL，接种于96孔板，100μL／孔。补充含不同浓度（浓度梯度分别为1、2、4g／L）复方马钱子的培养基100μL／孔，每组4个复孔。置于体积分数5%CO2培养箱内37°C培 养48h，加5g／L的MTT溶液（PBS配置）100μL／孔，继续培养4h，加MDSO 100μL／孔，于酶标仪490nm 测吸光度。计算细胞生长指数和促进率，讨论复方马钱子对小鼠淋巴细胞增殖的影响。

细胞生长指数＝A（加药组）／A（对照组）×100%。

促进率＝［（OD 加药组－OD 对照组）／OD 加药组］×100%

2.3 复方马钱子对肿瘤细胞增殖的影响

将HCT－116大肠癌细胞用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液（内含青霉素和链霉素100U／mL）调成2×106个／mL，接种于96孔板，100μL／孔。加含不同浓度（浓度梯度分别为1、2、4g／L）复方马钱子的培养基100μL／孔，每组4个复孔。置于体积分数5%CO2培养箱内37°C 培养48h，加5g／L MTT溶液（PBS配置），100μL／孔，继续培养4h，加MDSO，100μL／孔，于酶标仪490nm 测吸光度，计算细胞生长指数和生长抑制率，讨论复方马钱子对肿瘤细胞增殖的影响。

细胞生长指数＝A（加药组）／A（对照组）×100%。

抑制率＝［（OD 对照组－OD 加药组）／OD 对照组］×100%。

2.4 复方马钱子对荷瘤小鼠体内离子、葡萄糖的影响

小鼠接种、分组及给药方案同“2.1”。全程治疗结束后，于次日小鼠眶静脉取血，分离血清，－20℃储存备用。

2.4.1 血清中Na＋含量的测定 用Na＋试剂盒测定，采用比浊法，测定原理为：在分散剂和除干扰剂的存在下，Na＋与6－氢氧化锑钾在分散剂的存在下与Na＋形成均一的浊度。在630nm 波长测定吸光度值，计算其含量。

钠离子含量（mmol／L）＝测定管吸光度／标准管吸光度×标准管浓度。

2.4.2 血清中K＋含量的测定 用K＋试剂盒测定，采用比浊法，其原理为：在碱性介质中，经蛋白沉淀剂处理后的血清样本中的K＋与NA－TPB 反应产生浑浊并有稳定的悬浮液。浑浊度与样本中K＋浓度成正比。在440nm 波长测定吸光度值，计算其含量。

钾离子含量（mmol／L）＝测定管吸光度／标准管吸光度×标准管浓度×样本测试前稀释倍数（10）。

2.4.3 血清中Cl－含量的测定 用Cl－试剂盒测定，采用比浊法，其原理为：用硫氰酸汞处理Cl－形成有色络合物，颜色深度与Cl－浓度呈正比。在480nm波长测定吸光度值，计算其含量。

氯离子含量（mmol／L）＝测定管吸光度／标准管吸光度×标准管浓度。

2.4.4 血清中葡萄糖含量的测定 用葡萄糖试剂盒测定，采用葡萄糖氧化酶－过氧化物酶法。其原理为：样品中的葡萄糖经葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和过氧化氢，后者在过氧化物酶作用下，将还原性4－氨基安替吡啉与酚偶联缩合成可被分光光度计测定的醌类化合物。在波长520nm 处以磷酸盐缓冲液替代血样空白反应管调零，读取标准管和样品管的吸光度值，计算其含量。

葡萄糖含量（mmol／L）＝样本管吸光度／标准管吸光度×标准管浓度。

2.5 统计学处理

采用Excel进行组间单因素方差分析。计算资料采用均数±标准差表示，两样本均数比较采用t检验，P＜0.05表示显著性差异，P＜0.01表示非常显著性差异。

3 结果

3.1 对荷瘤小鼠体质量、肿瘤及免疫器官的影响

3.1.1 对荷瘤小鼠体质量的影响与对照组小鼠相比较，复方马钱子给药组的小鼠体质量呈明显下降趋势，见图1。

3.1.2 对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响与对照组小鼠相比较，复方马钱子对肿瘤有明显的抑制作用，抑瘤率为61.75%，见图2、表1。

图1 复方马钱子对小鼠体质量的影响

图2 复方马钱子对肿瘤生长的影响

表1 复方马钱子对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响（，n＝10）

3.1.3 对荷瘤小鼠免疫器官指数的影响与对照组小鼠比较，复方马钱子组小鼠胸腺指数和脾脏指数显著下降，肝脏指数无明显改变，见表2。

3.2 对肿瘤细胞增殖的影响

复方马钱子对HCT－116大肠癌细胞成剂量依赖性抑制作用，对淋巴细胞增殖无明显影响，见表3、表4。

表2 荷瘤小鼠免疫器官指数（，n＝10）

表3 复方马钱子对HCT－116大肠癌细胞增殖的影响（，n＝6）

3.3 对荷瘤小鼠体内离子的影响

与正常组（非荷瘤小鼠）相比，对照组小鼠血清中Na＋、Cl－含量降低（P＜0.01），K＋、Glu 含量升高（P＜0.01）。与对照组相比较，给药组血清中K＋、Cl－、Glu含量升高，但Na＋改变不明显，见表5。

表4 复方马钱子对小鼠淋巴细胞增殖的影响（，n＝6）

表5 复方马钱子对荷瘤小鼠血清中Na＋、K＋、Cl－、Glu含量的影响（，n＝10）

4 讨论

总生物碱是马钱子中最主要的有效成分，目前的研究［7］表明，马钱子总生物碱中至少有16 种生物碱成分，主要成分是士的宁和马钱子碱，而士的宁过量中毒可引起肢体颤动、惊厥、呼吸困难，甚至昏迷，严重的可危及生命［8］。实验中，给予0.2L／10g的复方马钱子剂量，小鼠并未出现明显的士的宁中毒症状，说明复方马钱子中的成分能有效对抗士的宁所致的惊厥，降低毒副作用，提高患者的生活质量。

现代医学表明，马钱子不但有较好的抗肿瘤、抗转移作用，还可明显缓解患者临床症状，改善生活质量，延长生存期，提高机体免疫力，已成为抗肿瘤中药研究的一个热点［9］。实验研究［10］发现，复方马钱子对肿瘤有显著的抑制作用，抑瘤率为61.75%，恶性肿瘤的发生与机体的免疫力低下或缺失密切相关。实验中，小鼠胸腺指数和脾脏指数均下降，说明复方马钱子对免疫器官有抑制作用，而对肝脏毒性作用不明显。

在肿瘤发生发展过程中，离子通道的表达和活性发生改变，这种异常表达和活性改变又与肿瘤细胞增殖和凋亡密切相关［11］。另外，葡萄糖的高消耗和逃避失常凋亡，也被认为是肿瘤细胞的特征性改变。实验显示，与正常组相比，荷瘤小鼠对照组血清中Na＋、Cl－含量显著降低，K＋含量显著升高，说明肿瘤的发生引起了机体电解质紊乱；与对照组相比，复方马钱子给药组血清中的K＋、Cl－含量显著增加，说明复方马钱子可调节离子通道而使电解质趋于正常，但具体机制尚不清楚，还需进一步探讨。荷瘤小鼠与正常组相比血清中葡萄糖含量升高，给药组与对照组相比葡萄糖含量显著下降，说明肿瘤的发生使机体代谢加强，而给药后的作用调节使代谢趋于正常水平。

［1］Papazisis K T，Kalemi T G，Zambouli D，et al.Synergistic effects of protein tyrosine inhibitor genistein with camptothecins against three lines in vitro［J］.Caner Lett，2006，233（2）：255－264.

［2］杜钢军，林海红，许启泰，等.灯盏花素促进阿霉素诱导的k562细胞凋亡［J］.中国药理学通报，2007，23（8）：1043－1045.

［3］石瑞.马钱子的临床应用［J］.中国民间疗法，2010，3（18）：64.

［4］王欣，李平.马钱子的药理作用［J］.中医药临床杂志，2008，4（20）：198－200.

［5］李佳桓，林海红，杜钢军，等.巴豆不同给药方式对荷瘤小鼠的影响［J］.河南大学学报：医学版，2012，31（1）：8－11.

［6］吴先闯，林海红，杜钢军，等.TGF－β1 抑制剂灯盏花素对肿瘤诱导的小鼠免疫抑制的逆转作用［J］.河南大学学报：医学版，2009，28（3）：174－177.

［7］蔡宝昌，吴皓，杨秀伟，等.马钱子中16个生物碱类化合物13CNMR谱的数据分析［J］.药学学报，1994，29（1）：44－48.

［8］焦杨.马钱子的研究进展［J］.医学理论与实践，2009，22（8）：918－919.

［9］侯风刚，贯剑.马钱子抗肿瘤研究进展［J］.上海中医药杂志，2009，43（2）：75－77.

［10］侯清玉，杨秀萍.肿瘤免疫逃逸的研究进展［J］.中华肿瘤防治杂志，2010，17（3）：228－231.

［11］缪克红，聂敏海.口腔肿瘤细胞离子通道的研究进展［J］.广东牙病防治，2010，18（8）：446－448.