家蝇3龄幼虫石蜡切片的组织学研究

胡 蓉，张 姝，吴建伟，国 果，付 萍

(贵阳医学院基础医学院，贵阳 550004)

石蜡切片技术是组织学研究最基本的实验方法。昆虫消化系统石蜡切片的组织学研究报道较多，如韭菜迟眼蕈蚊幼虫(Song et al.，2004)、兴义维蚋成熟幼虫(Xun et al.，2011)、黄脸油葫芦(Lu et al.，2009)等。但昆虫坚硬的外壳(皮)和开放的循环系统等却制约了整虫组织的石蜡切片制作，昆虫整虫石蜡切片的组织学研究报道较少，具有代表性的是改良的石蜡切片法研究致倦库蚊组织结构(Yan et al.，2011)。家蝇Musca domestica 是分布广泛的环境昆虫(Su ZJ et al.，2010)，其组织器官的结构及功能分子的定位一直备受关注，国内的研究主要有:3龄幼虫血细胞体外荧光染色(Liu et al.，2008)、雌家蝇产卵器和足上感受器的扫描电镜观察(Wang and Mo，2010)，利用冰冻切片定位抗菌肽基因(Yang et al.，2012)等;国外的主要研究是通过电镜观察蛹(Siriwattanarungsee et al.，2005)、1龄幼虫(Szpila and Pape，2008)、马氏管(Sohal，1974)和唾液腺(Lietze et al.，2011)的超微结构，在定位基因表达部位时涉及到成虫头部石蜡切片(Codd et al.，2007)以及幼虫和成虫中枢神经系的组织切片(Sha et al.，2012)。关于家蝇整虫石蜡切片的组织学研究尚未见报道。本研究以家蝇3龄幼虫为研究对象，探索合适的石蜡切片制作方法，并通过苏木精－伊红(hematoxylin－eosin，HE)染色、过碘酸－希夫氏(periodic acid－schiff，PAS)染色显示家蝇幼虫的组织结构以及多糖和糖蛋白的分布，为家蝇3龄幼虫的组织学研究提供系统的形态学资料，并为进一步定位家蝇的功能分子提供可靠的实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验昆虫

家蝇幼虫为贵阳医学院寄生虫学教研室驯化饲养多代的室内种群。

1.1.2 主要试剂及仪器

多聚甲醛(Sigma)，苏木精(Sigma)，伊红(Sigma)，石蜡、过碘酸、碱性品红等为国产分析纯，A0821S 回转式切片机(AO)，载玻片烘干机(Leica)，DME 321058943PX 显微镜带一体化摄像头(Leica)。

1.2 方法

1.2.1 石蜡切片的制备

按照杜卓明主编《实用组织学技术》配制相关试剂并制作家蝇3龄幼虫组织切片(Du ZhM，1988)，固定剂用Carnoy 液或含0.25% TritonX－100的4% 多聚甲醛液(Yan et al.，2011)，切片厚4～6 μm。

1.2.2 组织学染色

1.2.2.1 HE 染色

二甲苯Ⅰ30 min，二甲苯Ⅱ30 min，纯乙醇Ⅰ、纯乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、70%乙醇各3 min，自来水洗擦干，苏木精染色10 min，自来水冲洗，酸酒精分色20 s，自来水冲洗，氨酒精蓝化3 min，自来水冲洗，伊红染色10 min，自来水冲洗，95% 乙醇分色，37℃烤片2 h，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察拍照。

1.2.2.2 PAS 染色

石蜡切片按1.2.2.1 的方法化蜡入水擦干后，过碘酸5 min，超纯水洗两遍，schiff 试剂(避光)30 min，超纯水洗两遍，部分切片经苏木精复染，超纯水洗，37℃烤片2 h，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察拍照。

2 结果与讨论

在多聚甲醛固定液中加入0.25% TritonX－100(Yan et al.，2011)或用Carnoy 固定液都适合于家蝇3龄幼虫的固定，而且固定后切除部分表皮，使脱水和浸蜡等过程能够顺利完成，才能得到组织结构完整、清晰的家蝇3龄幼虫石蜡切片。冠状面HE 染色显示，家蝇3龄幼虫体节明显，组织结构主要包括消化系统、中枢神经系统、排泄系统、血细胞、呼吸系统、表皮、肌肉和脂肪体等(图1)。表皮、肌肉以及脂肪体是家蝇3龄幼虫体壁的主要组成成分，较多成群分布的脂肪体细胞与其它器官一起分布于体腔中，血淋巴呈染成均质的粉色。消化系统由肠道和唾液腺组成。肠道为纵贯体腔中央的长管状结构，从头节口腔开始，止于腹节末端的肛门处，分为前肠、中肠和后肠三部分。切片显示前肠由咽部、嗉囊、食道、前胃和胃盲囊组成，主要位于胸节，而中肠是肠道中最长的器官，故在腹节可见多个中肠切面，腹节末端可见后肠切面。唾液腺位于胸节，可延伸到第1～2 腹节。中枢神经系统位于胸节，可见对称分布的脑组织。排泄系统主要是马氏管，位于中肠和后肠周围的体腔内。血细胞大多集聚在3龄幼虫尾部。呼吸系统主要由气管及其分支构成，开口于前后气门。

图1 家蝇3龄幼虫冠状面HE 染色全视图Fig.1 General view of coronal plane of the third instar of Musca domestica with HE staining

2.1 肠道

家蝇3龄幼虫的前肠包括咽部、嗉囊、食道、前胃和胃盲囊。咽部后方通过薄层扁平上皮与嗉囊相连接(图2A)。嗉囊壁厚，可分为4～5 层(图2B)，外膜为一层单层扁平上皮，胞质强嗜碱性;内有一层弹性膜，呈均质嗜酸性的波浪状;弹性膜内为较厚的结缔组织;PAS 染色显示弹性膜与结缔组织之间有一层梭形细胞，含丰富的糖原颗粒;内层为单层立方或柱状上皮，胞质嗜碱性。嗉囊末端与食道相连(图2C)，食道管壁主要由单层扁平上皮和平滑肌层构成。食道末端内陷入前胃，构成一个特殊套管样结构(图2D)，内衬食道上皮和肌层，外被高锥形上皮;外表面是一层强嗜碱性上皮。前胃与中肠交汇处发出2 对细长的胃盲囊(图2E)，胃盲囊上皮由单层细胞构成，上皮起始部的细胞呈锥形，逐渐移行为立方形至矮柱状。

中肠的不同部位，上皮的形态各异。中肠起始部的上皮为单层高圆锥形(图2D，F)，细胞核卵圆形居中，核染色质疏松;PAS 染色中肠上皮腔面见紫红色、整齐排列的纹状缘(图2F)。远离起始部的上皮细胞逐渐变为矮圆锥形，甚至移行为单层扁平上皮，肠腔内容物被围食膜包裹(图2G)。围食膜为弱嗜碱性的薄膜状结构，与肠壁细胞间有一空隙，内含上皮细胞生命活动的各种产物。

后肠可分为3个部分，幽门、回肠和直肠。幽门位于后肠与中肠交界处，即马氏管汇入处，上皮向肠腔内褶形成嵴(图2H)，肠壁细胞结构模糊，可见卵圆形的细胞核，肌层较发达。回肠组织结构与幽门相似(图2I)。直肠肠腔较窄，上皮无嵴状突起，上皮细胞为立方形(图2J)。

家蝇3龄幼虫嗉囊和前胃的结构是前肠中较特异的部分。石蜡切片HE 染色和PAS 染色显示，嗉囊壁厚，又有弹性膜，说明嗉囊可以调节囊内容物的容量，切片显示的是空虚时的嗉囊壁厚腔小;其前端肌肉组织丰富，可能有防止食物反流至咽部的作用。前胃中央食道内陷形成套管样结构、中肠不同区域上皮的组织结构明显不同、以及后肠分为幽门、回肠和直肠等研究结果与兴义维蚋Wilhelmia xingyiense Chen and Zhang 成熟幼虫消化道的结构(Xun et al.，2011)相似。而回肠与胃盲囊的结构与韭菜迟眼蕈蚊 Bradysia odoriphaga 幼虫的组织学研究(Song et al.，2004)基本一致。家蝇3龄幼虫中肠可见围食膜，这为中肠上皮细胞免受食物颗粒的机械性损伤和以食物为载体的病原体的入侵提供了结构基础(Zhang et al.，2009)。

2.2 唾液腺

图2 家蝇3龄幼虫石蜡切片Fig.2 Paraffin tissue sections of the third instar of Musca domestica

家蝇3龄幼虫有一对单管泡状的唾液腺(图2K)，对称分布于前肠及神经组织的两侧。分泌部细胞近导管端为梭形，远离导管端为圆锥形，上皮细胞的形态特点与研究人员(Lietze，et al.，2011)在透射电镜下观察到的细胞形态相符合。而且还可清楚地辨别两种嗜色性不同的细胞(图2L)，嗜酸性细胞胞质内含有大量紫红色的酶原颗粒，嗜碱性细胞胞质内充满嗜碱性颗粒，这为研究唾液腺的分泌细胞和非分泌细胞提供了形态学基础。

2.3 中枢神经系统

家蝇3龄幼虫中枢神经系统的构成与果蝇(Gong and Liu，2011)的相似，也为脑－腹神经索复合体(Sha et al.，2012)，主要由脑和腹神经索组成(图2M)。腹神经索周边神经元较多(图2N)，细胞核大而圆，核染色浅，核仁明显(图2O)，中央主要是神经元突起所在的部位，染成粉红色。

2.4 马氏管

家蝇3龄幼虫有2 条细长的马氏管，末断游离于消化道周围，近端汇入中肠与后肠分界处(图2H)，马氏管上皮由单层细胞围成(图2P)，细胞核大，卵圆形，凸向腔面，细胞质丰富，PAS 染色上皮游离面纹状缘明显(图2Q)，这些组织结构与学者们对家蝇马氏管的电镜研究相符合(Sohal，1974)，为证明马氏管上皮也具有吸收功能提供了形态学依据。

2.5 血细胞

HE 染色的石蜡切片中家蝇3龄幼虫的血细胞的形态清楚，分为原血胞、浆血胞、粒血胞、珠血胞以及类绛血胞5类(图2R)。原血胞较小，呈圆形，细胞核大而圆，胞质很少。浆血胞大小不一，圆形或卵圆形，细胞核圆形，核染色质致密，沿核的中心向四周呈辐射状分布，形似车轮状，这是浆血胞s 的典型特征，胞质丰富，强嗜碱性。粒血胞圆形或卵圆形，细胞核染色浅，轮廓不清楚，胞质内有大小不等的嗜碱性颗粒，颗粒可覆盖在细胞核上。珠血胞体积较大，细胞核圆形或卵圆形，染色浅，核仁明显，细胞质内含大量嗜碱性颗粒，颗粒大小一致，分布均匀。类绛血胞体积最大，且大小不一，多为圆形，核圆居中，胞质充满粗大的嗜酸性颗粒，颗粒折光性强，较大的类绛血胞细胞壁容易破裂。家蝇幼虫血细胞HE 染色的特点与体外荧光染色(Liu et al.，2008)的形态特征互为补充。

2.6 气管及其分支

家蝇3龄幼虫的呼吸系统由气管及分支形成的支气管树构成，终端开口于前、后气门。各级气管分支的组织结构与气管相同，只是管腔逐渐变小，管壁逐渐变薄。气管上皮为单层扁平上皮(图2S)，与电镜下微气管(Lietze et al.，2011)的结构相似，胞质较少，强嗜碱性，细胞核卵圆形，上皮腔面有一层嗜酸性均质状的内膜，形如栅栏状。

2.7 表皮、肌组织及脂肪体

表皮由浅表的几丁质层和深部的表皮细胞构成(图2S)。几丁质层厚，呈嗜酸性，且越接近体表嗜酸性越强;表皮细胞为单层锥形，胞质强嗜碱性。表皮内侧有较多骨骼肌，可见明显的横纹(图2T)，体腔内有大量脂肪体，由多边形的多泡脂肪细胞构成，其组织结构与致倦库蚊(Yan et al.，2011)的相似。。PAS 染色显示，表皮细胞、骨骼肌纤维和脂肪体细胞的胞质内均可见染成紫红色的糖原颗粒(图2A，T)。糖原是动物和细菌内糖的贮存形式，还含有多糖合成和代谢的酶等，多以颗粒形式贮存于肝和肌肉的细胞质中。昆虫的脂肪体相当于其它动物的肝脏。家蝇的肌组织、脂肪体和表皮细胞贮存的糖原为家蝇在复杂条件下的生命活动提供了能量储备。

本研究为家蝇3龄幼虫石蜡切片的制作方法提供了参考，并获得了家蝇3龄幼虫较系统和全面的组织学资料。这些研究结果为蝇类的分类和防治提供了形态学资料，也为进一步应用原位杂交和免疫组织化学技术研究家蝇功能分子(Zhang et al.，2013)的表达提供了可靠的实验基础。

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