胰岛素对糖尿病大鼠肺组织基质金属蛋白酶2表达的影响＊

周训美，赵 倩，李 建，陈 袁，李显文

(遵义医学院附属医院内分泌科，贵州遵义 563099)

本研究通过检测糖尿病大鼠肺组织MMP－2的表达，以及不同胰岛素干预时间肺组织内MMP－2表达的变化，探讨精蛋白锌胰岛素对糖尿病大鼠肺组织内MMP－2表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料 8周龄体重180～240g的Sprague Dawley雄性大鼠60只，清洁级，购自第三军医大学大坪医院动物实验中心，按普通级饲养。高糖高脂饲料购自第三军医大学大坪医院动物实验中心，配置比例:基础饲料70%，猪油9%，白糖12%，鸡蛋9%。链脲佐菌素购自美国Sigma生物公司。精蛋白锌胰岛素购自江苏万邦药业有限公司。稳豪血糖仪及血糖试纸条购自美国强生公司。MMP－2一抗、二抗购自武汉博士德生物公司。

1.2 动物模型的建立 8周龄180～240 g的SD雄性大鼠，随机分为3组。对照组(n=20)普通饲料饲养3周后给予0.1 mmol/L、pH值4.4的枸橼酸缓冲液向腹腔内注射。糖尿病组(n=20)、胰岛素组(n=20)，普通饲料适应性喂养1周、高糖高脂饲料喂养2周后，1%链脲佐菌素40 mg/kg腹腔内注射(用0.1 mmol/L，pH值4.4枸橼酸缓冲液配置)。3～7 d后针刺鼠尾取血查随机末梢血糖，以≥16.7 mmol/L为入选标准。造模完成后对照组给予普通饲料饲养，糖尿病组、胰岛素组继续给予高糖高脂饲料饲养。对照组、糖尿病组不给予药物干预，胰岛素组予精蛋白锌胰岛素3～5 IU皮下注射1次/d，每周监测2～3次血糖，根据血糖调整胰岛素剂量，使随机血糖控制在10 mmol/L以下，每周检测体重。分别于成模后第4周、8周禁食10～12 h后测空腹末梢血糖。4%水合氯醛麻醉处死大鼠，打开胸腔，取出肺脏，10%中性甲醛固定，脱水，石蜡包埋，常规切片，行HE染色，免疫组化检测基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinases，MMP －2)。

1.3 MMP－2免疫组化方法 切片常规脱蜡至水，PBS清洗3次，5 min/次，双蒸水清洗3次，5 min/次，0.1 moL/L枸橼酸缓冲液(pH值6.0)微波炉内中火修复10 min，冷却至室温后滴加一抗(兔抗鼠1∶50)，湿盒4℃孵育18 h，0.01 mol/L PBS 清洗3次，5 min/次，滴加二抗(山羊抗兔)工作液，湿盒37℃温箱孵育20 min，0.01 mol/L，PBS清洗3次，5 min/次，光镜观察下DAB显色1～2 min，自来水充分冲洗终止显色，苏木精复染5 min，0.1%盐酸酒精清洗15 s，梯度乙醇脱水，烘箱干燥，透明中性树胶封固。以细胞浆和(或)细胞核棕黄或黄色颗粒为表达阳性。

1.4 HE染色 肺组织做4 μL连续切片。

1.5 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差(s)表示，3组间采用方差分析，不同时间采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 空腹血糖 第4周，对照组与糖尿病组比较差异有统计学意义(P＜0.05);对照组与胰岛素比较差异无统计学意义(P＞0.05);糖尿病组与胰岛素组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。第8周，对照组与糖尿病组比较差异有统计学意义(P＜0.05);对照组与胰岛素组比较差异无统计学意义(P＞0.05);糖尿病组与胰岛素组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。同组第8周与第4周比较，3组间均无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 体重 第4周，对照组与糖尿病组比较差异有统计学意义(P＜0.05);对照组与胰岛素比较差异无统计学意义(P＞0.05);糖尿病组与胰岛素组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。第8周，对照组与糖尿病组比较差异有统计学意义(P＜0.05);对照组与胰岛素组比较差异无统计学意义(P＞0.05);糖尿病组与胰岛素组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。同组第8周与第4周比较，对照组差异有统计学意义(P＜0.05);糖尿病组差异无统计学意义(P＞0.05);胰岛素组差异有统计学意义(P＜0.05)(见表1)。

表1 各组不同时间血糖、体重变化比较(s)

表1 各组不同时间血糖、体重变化比较(s)

注:与同时间点对照组比较*P＜0.05，与同时间点糖尿病比较▲P＜0.05，与同组第4周比较△P＜0.05。

组 别 (n=10)空腹血糖(mmol/L)体重(g)对 照 组 4周5.3 ±2.3 355.2 ±26.5 8 周 4.6 ±0.8 406.2 ±37.2△糖尿病组 4周 29.3±5.5* 278.4±12.2*8 周 30.5 ±1.4* 263.2 ±15.2*胰岛素组 4周 6.1±1.3▲ 344.1±12.1▲8 周 5.6 ±1.6▲ 421.1 ±23.3▲△

2.3 HE光镜结果对照组 第4周大鼠肺泡形态完整，由单层肺泡上皮组成，相邻肺泡之间有少量结缔组织，可见散在的淋巴细胞，见少许散在中性粒细胞，第8周较第4周无明显变化。糖尿病组:第4周大鼠肺泡形态欠完整，单层肺泡上皮构成，基膜增多，可见中性粒细胞、淋巴细胞浸润，可见散在新生血管形成。第8周肺泡结构紊乱，多层肺泡上皮构成，炎症细胞浸润加重，炎症严重区域可见少量散在纤维母细胞，成纤维细胞。可见新生血管形成，血管管壁增厚，支气管粘膜细胞、血管平滑肌细胞胞核固缩。胰岛素组:第4周肺泡形态基本完整，部分肺泡形态欠完整，均由单层肺泡上皮组成，相邻肺泡之间有少量结缔组织，可见淋巴细胞。第8周较第4周改变不明显。

2.4 MMP－2免疫组化结果 各组大鼠肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞、血管内皮细胞胞浆可见表达，少数支气管上皮细胞胞核中见弱阳性表达。第8周糖尿病大鼠除上述细胞阳性表达增加外，还可见于肺泡间隔、肺泡腔内的巨噬细胞表达阳性。第4周，MMP－2染色光密度值3组间差异均无统计学意义(P＞0.05)。第8周，对照组与糖尿病组比较差异有统计学意义(P＜0.05);对照组与胰岛素组比较差异无统计学意义(P＞0.05);糖尿病组与胰岛素组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。同组第8周与第4周比较，对照组统计差异无统计学意义(P＞0.05);第8周糖尿病组大鼠阳性染色光密度值高于同期对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05);胰岛素组差异无统计学意义(P＞0.05)(见表2、图 1)。

表2 不同时间各组MMP－2阳性染色光密度值(n=10)(s)

表2 不同时间各组MMP－2阳性染色光密度值(n=10)(s)

注:与同时间点对照组比较*P＜0.05，与同时间点糖尿病比较▲P＜0.05，与同组第4周比较△P＜0.05。

组 别 第4周 第8周0.224 ±0.012 0.243 ±0.016糖尿病组 0.214 ±0.254 0.277 ±0.344＊△胰岛素组 0.239 ±0.156 0.245 ±0.221对照组▲

图1 肺组织内MMP－2表达(免疫组化×400)

3 讨论

糖尿病主要引起血管病变，可导致神经、心血管、视网膜、肾脏等器官、组织损害。肺脏血管分布丰富，大小血管均存在，在高血糖的影响下，可发生淋巴细胞、中性粒细胞浸润，长时间后可能造成形态学改变、容易发生肺部感染，甚至导致肺纤维化，肺功能损害，出现通气和弥散障碍。当前，人们对糖尿病所导致的心肌病、脑血管病变、肾脏病变、神经病变、眼底血管病变已有了广泛的研究，但对糖尿病引起的肺损伤，特别是肺纤维化研究相对较少。

基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)是一类结构同源的含锌离子、活性钙离子的内肽酶的总称，因含有金属离子而得名［1］。它可降解和调节细胞外基质中多种蛋白成分、使之保持动态平衡。其主要来源于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞以及肿瘤细胞等。研究表明，在空腹血糖受损和IGT时即可有多种MMPs表达升高［2］。迄今发现28种基质蛋白酶类。按照作用的底物又分为五类［3－4］。第一类:胶原酶(MMP－1、MMP－8、MMP－13、MMP－18)，第二类:明胶酶(MMP－2、MMP－9)，第三类:间质溶素(MMP－3、MMP－10、MMP－11)，第四类:膜型 MMPs(MMP －14、MMP－15、MMP－16、MMP －17)，第五类:其他 MMPs，如明胶、FN、LN、内皮粘连蛋白等。其中MMP－2也叫明胶酶A。MMP－2是所有MMP中分布最广的。它主要降解明胶、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ胶原、纤维连接蛋白等细胞外基质［5－6］，破坏基底膜，促进与炎症有关的细胞的迁移以及ECM重建。正常肺组织中，MMP－2呈弱性表达。当细胞恶变或组织受损时，常伴有MMP－2的升高，抑制MMP－2的活性可减轻肺损伤。

胰岛素可以降低血糖，解除高糖毒性，减轻组织非酶促糖基化、山梨醇旁路活化及机体的氧化应激，与血小板的胰岛素受体结合，降低血栓素A2生成，有效地减少血小板聚集，改善组织血供状态［7］。经胰岛素治疗后血糖水平恢复恒定，肺通气/灌注比(V/Q)和肺弥散(DLCO)改善。经观察，血糖经胰岛素治疗基本正常者与未予胰岛素治疗血糖控制不理想者比较，后者同期肺功能损伤明显［1］。除此之外，胰岛素还有抑制前炎症细胞因子、自由基的产生，增加抗炎细胞因子的非降糖作用，可引起外周血管扩张和阻止细胞凋亡，防止组织缺血再灌注损害。胰岛素还可扩血管、改善血脂谱、促进NO的分泌、降低PAI－1、抑制血小板聚集。降低MMP－2、血管内皮生长因子 (VEGF)等促进内皮细胞增生因子在血中的浓度，有抗动脉粥样硬化的作用。甘精胰岛素在升高抗氧化酶的活性的同时有降低促氧化酶活性的作用，通过抑制机体脂质过氧化反应，从而使机体功能免受氧化损伤。

从本研究肺组织HE染色图片分析:糖尿病组与对照组相比，大鼠肺组织病理学改变表现为炎症细胞的大量浸润、新生血管形成、结缔组织增生、肺泡结构破坏。随着病程进展，肺损伤进一步加重，表现为肺泡腔容积缩小，肺间质明显增生。而胰岛素能显著减轻糖尿病所致的肺组织结构损害，并有效改善其组织病理学损伤的恢复。从肺组织内MMP－2表达水平结果分析:在第4周，MMP－2的表达在各组之间无明显差异。至第8周，糖尿病组肺组织MMP－2的表达较对照组明显增加，胰岛素组肺组织MMP－2的表达较糖尿病组明显下降。表明糖尿病时大鼠肺组织MMP－2的表达增高，而胰岛素则抑制了MMP－2的表达。

本研究表明，糖尿病可导致肺脏损害。高血糖可导致肺组织MMP－2的表达增高，MMP－2的过度表达导致和(或)加重了肺组织内大量炎性细胞浸润、肺基质结构破坏等一系列肺损伤表现，导致了糖尿病肺损伤的发生、发展。胰岛素治疗糖尿病，在降低血糖的同时，抑制了MMP－2的表达，减轻了糖尿病所致肺组织损伤。

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