木棉叶总黄酮的提取工艺优化研究

曾小平 单桂根 陈小锐

木棉叶总黄酮的提取工艺优化研究

曾小平 单桂根 陈小锐

目的确定木棉叶总黄酮的最佳提取工艺条件。方法采用分光光度法，以槲皮素为标准品测定木棉叶中的总黄酮含量，在单因素实验的基础上通过正交实验对木棉叶总黄酮提取工艺条件进行优化。结果确定木棉叶总黄酮的最佳提取工艺为取70目的药材加入20倍量的80%乙醇回流1h，该提取工艺的总黄酮得率为25.172mg/g。结论本提取工艺具有简单、可靠、准确的特点，可作为木棉叶总黄酮的最佳提取工艺。

木棉叶；总黄酮；工艺条件

木棉Gossampinus malabaria（DC.）Merr为木棉科木棉属的植物，原产地为中国、越南、缅甸、印度等地。研究表明，木棉的主要化学成分为挥发性成分、三萜及黄酮类化合物，药理活性主要有抗菌、抗炎、抗肿瘤及肝损伤保护等[1]。在木棉叶中分离出具有一定活性的黄酮类化合物，其中具有代表性的是槲皮素[2-3]。目前尚未见对木棉叶总黄酮提取工艺的报道，故本研究将在单因素实验的基础上通过正交设计实验对木棉叶总黄酮提取工艺条件进行优化，为今后开发利用木棉叶总黄酮作铺垫和参考。

1 材料与仪器

1.1 实验原料木棉叶：广东翁源县出品。

1.2 实验仪器和主要试剂S22PC分光光度计（上海棱光技术有限公司）；BP211D电子分析天平（德国赛多利斯）；DFY-300摇摆式中药粉碎机（中国浙江温岭市林大机械有限公司）；KQ-200VDB型双频数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；槲皮素对照品（100081-201106）；乙醇等均为分析纯。

2 实验方法

2.1 样品处理木棉树叶阴干，称取100g粉碎过筛网，置500ml锥形瓶中，加入200ml石油醚（60～90℃）搅拌摇匀后，静置过夜，滤纸过滤，粉末50℃烘干，备用。

2.2 标准品溶液的制备精密称取在105℃干燥至恒重的槲皮素对照品25.05mg，置100ml容量瓶中，加入80%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度0.2505mg/ml的槲皮素标准溶液。

2.3 最大波长的选择精密吸取2.1中配制好的标准品5ml于50ml量瓶中，加入80%乙醇定容至刻度，在200～800nm进行全波长扫描，结果发现在360nm处有最大吸收，所以选择360nm为测量波长。

2.4 标准曲线的测定精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml置于50ml量瓶中，加入80%乙醇定容至刻度。在最大波长360nm处，以槲皮素浓度（x）对吸光度（y）绘制标准曲线。结果表明，槲皮素溶液浓度在0.005～0.030mg/ml内，浓度（x）与吸光度（y）之间呈良好的线性关系，如图1。

图1 槲皮素标准曲线

2.5 样品总黄酮含量测定精密量取样品黄酮提取液10ml，置50ml容量瓶中，并加入PH=3.0的HCl溶液5ml与80%乙醇定容至刻度，摇匀，静置10min，在波长360nm下测定吸光度。根据标准曲线计算提取液中总黄酮含量。总黄酮得率以1g原料中总黄酮的含量（mg）计算。

3 结果与分析

3.1 单因素实验

3.1.1 不同倍量溶剂的选择精密称取2.1中处理的木棉叶干粉末3g，放入250ml的圆底烧瓶中，加入80%乙醇（5倍量、10倍量、15倍量、20倍量、25倍量、30倍量），在80℃水浴回流中提取2h，后用滤纸过滤，滤液待用。按2.5中方法测定总黄酮含量。由图2可知，溶剂用量10～15倍时黄酮得率相对较高，当15倍量时总黄酮得率最高。

图2 提取溶剂倍量对总黄酮的影响

3.1.2 不同乙醇浓度的选择按15倍量加入乙醇，浓度变量（50%、60%、70%、80%、90%），其余操作同3.1.1中方法。由图3可见，乙醇浓度为70%～90%时对黄酮得率的影响明显，当80%乙醇时总黄酮得率最高。

图3 乙醇浓度对提取效果的影响

3.1.3 不同回流时间的选择按15倍量加入乙醇，回流时间变量为（1、2、3、4、5h），乙醇浓度为80%，其余操作同3.1.1中方法。由图4可见，回流时间对总黄酮得率的影响不明显，但当回流时间为2h时总黄酮得率最高。

图4 回流时间对提取效果的影响

3.1.4 不同粉碎粒度的选择药材粉碎时采用不同型号的筛网（50、60、70、80、100目），过筛后分别按15倍量加入浓度为80%乙醇，回流时间为2h，其余操作同3.1.1中方法。由图5可见，不同药材粉碎粒度对黄酮得率的影响明显，当粉碎粒度为70目时总黄酮得率最高。

图5 不同粉碎粒度对提取效果的影响

3.2 正交实验根据单因素试验选择各因素主要影响水平，回流温度（A）、回流时间（B）、提取溶剂倍量（C）和乙醇浓度（D）进行L9（34）正交实验（各因素水平及结果见表1、2）。

表1 正交实验因素和水平

表2 木棉叶总黄酮提取工艺优化L9(34)正交实验设计及结果

表3 木棉叶总黄酮提取工艺优化方差分析结果

从表2结果可知，各因素影响的主次顺序为乙醇浓度＞回流温度＞加入乙醇倍量＞回流时间。表3方差分析结果显示，最佳提取工艺为A2B3C3D2，即取70目的药材加入20倍量的80%乙醇回流5h。

3.3 工艺验证提取时间越长，黄酮类物质浸出提取越完全，但随着时间的延长杂质浸出同时也增多，且黄酮长期处于高温溶液中易被氧化，回流时间对总黄酮得率的影响并不明显，所以进行工艺验证时选择回流时间分别为1h和5h，即按A2B3C3D2和A2B1C3D2两种工艺条件提取黄酮，平行测定3份进行对比。结果表明，两种工艺条件总黄酮得率平均分别为25.176mg/g、25.172mg/g。本着节约成本的原则，确定木棉叶总黄酮的最佳工艺为A2B1C3D2，即加入20倍量的80%乙醇在70℃水浴回流1h。

4 讨论

本实验通过单因素考查和正交实验结合工艺验证确定了木棉叶总黄酮的最佳提取工艺，取70目的药材加入20倍量的80%乙醇回流1h。本提取工艺具有简单、稳定、准确的特点。在单因素实验中，可得出提取时间对总黄酮的提取率影响不明显，从考虑到节约成本和工艺简单化的情况下进行工艺验证，确定了最佳的提取时间为1h。根据相关研究报道[4-5]，木棉叶的总黄酮主要以黄酮苷的形式存在，所以在总黄酮的提取过程中，加入适量的酸水可使其水解。植物中所含的色素往往对吸收峰有干扰，所以有必要去除一部分色素，采用石油醚萃取法可去除木棉叶中的绝大部分色素[6]，对回流提取法具有实用性、安全性及简单性，在实现大规模生产应用中更能体现其设备要求低、简便、成本低廉的特点。

[1] 江苏新医学院.中药大辞典·上册[M].上海：上海科学技术出版社,1975：364.

[2] 齐一萍,郭舜民.木棉的化学成分与药理作用研究[J].福建医药杂志,2002,24(3)：119.

[3] 王国凯,林彬彬,刘欣欣,等.木棉叶酚性成分研究[J].天然产物研究与开发,2012,24(03)：336-338,341.

[4] 刘欣欣,王国凯,秦民坚.紫外分光光度法测定木棉叶中总黄酮的含量[J].中国野生植物资源,2011,30(06)：70-72.

[5] 周丽.葛根异黄酮的提取、纯化及水解工艺的研究[D].东北农业大学,2012.

[6] 崔旭海.银杏叶黄酮类化合物提取分离技术的研究进展[J].食品工程,2008(4)：7-11.

Study on Optimum Process for Extraction of Total flavonoids from Gossampinus Malabaria Leaf

Zeng Xiaoping Shan Guigen Chen Xiaorui

ObjectiveTo determine the optimum extraction condition of total flavonoids from gossampinus malabaria leaf.MethodsIn this study,one-factor and orthogonal array design methods were used to optimize of total flavonoids from gossampinus malabaria leaf. The determination of total flavonoids was spectrometrically carried out using quercetin as the reference standard.ResultsThe optimal conditions for extracting total flavonoids from gossampinus malabaria leaf were 20 times the amount of ethanol, 80% ethanol as the extraction solvent, extraction time 1h, and 70 mesh crushed.The total flavonoids with the extraction process was 25.172mg/g.ConclusionThe extraction method is simple, rliable, and accurate, which can be used as the optimum extraction conditions of total flavonoids from gossampinus malabaria leaf.

Gossampinus malabaria leaf; Total flavonoids; Extraction condition

R284.2

A

1673-5846(2013)06-0033-03

清远市食品药品检验所，广东清远 511517