分泌型簇集素蛋白在肺癌细胞株中生物学行为的研究

马晓罗晓莹李宗海李鹤成

1.复旦大学附属肿瘤医院胸外科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032

2.上海交通大学医学院附属仁济医院上海市肿瘤研究所，上海 200032

分泌型簇集素蛋白在肺癌细胞株中生物学行为的研究

马晓1罗晓莹2李宗海2李鹤成1

1.复旦大学附属肿瘤医院胸外科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032

2.上海交通大学医学院附属仁济医院上海市肿瘤研究所，上海 200032

背景与目的：簇集素蛋白(clusterin，CLU)在肺癌的发生、发展中发挥重要作用。本研究用分泌型CLU体外处理肺癌细胞株，旨在探讨分泌型CLU对肺癌细胞株的影响。方法：用真核表达纯化的分泌型CLU处理非小细胞肺癌细胞株H460、A549，采用Boyden小室试验检测细胞的迁移能力，用CCK8检测细胞的增殖能力，利用芯片技术分析CLU处理H460细胞的microRNA表达谱，然后采用实时荧光定量PCR检测分泌型CLU处理H460细胞中microRNA的表达，初步分析分泌型CLU执行肿瘤生物学功能的microRNA相关分子机制。结果：分泌型CLU处理组H460迁移的细胞是BSA处理组的3.10倍(P＜0.000 1)；分泌型CLU处理组A549迁移的细胞是BSA处理组的3.40倍(P＜0.000 1)；分泌型CLU抑制了肺癌细胞株H460/A549的生长(P＜0.000 1)；利用芯片技术发现microRNA-302b-3p、microRNA-23a-5p和microRNA-101-5p高表达。结论：在非小细胞肺癌细胞株H460/A549中，真核表达的分泌型CLU促进了细胞迁移、抑制了细胞生长，并且能引起microRNA表达谱的改变，本研究为探索分泌型CLU在非小细胞肺癌中的作用提供了重要的实验依据。

分泌型簇集素蛋白；非小细胞肺癌；细胞迁移；microRNA

肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类的健康和生活质量。据统计，全世界每年因肺癌死亡的患者有140万，约占所有恶性肿瘤死亡的18%［1］。相关研究显示，肿瘤细胞的恶性转化、无限增殖及凋亡调控失衡参与肿瘤的发生、发展［2］。肺癌的发生、发展是多因素、多步发展的复杂过程，包括原癌基因的活化、抑癌基因的失活等，其中细胞增殖和凋亡之间的失衡是重要的因素。

簇集素蛋白(clusterin，CLU)是一个广泛糖基化的蛋白，其生物学意义仍然存在争议。CLU在正常成熟组织中低表达而选择性的在某些恶性肿瘤中高表达，如肺癌，前列腺癌，乳腺癌、卵巢癌及宫颈癌等［3］。CLU因能使不同的细胞聚集而命名［4］，由于选择性剪接的结果，其有两种主要的亚型，多功能分子伴侣分泌型CLU(sCLU)和促凋亡的核型CLU (nCLU)［5］。sCLU开始是一条相对分子质量约60×103的前体多肽，经过裂解和糖基化形成了α和β链，每条链相对分子质量约40×103，并最终形成分泌型异二聚体，相对分子质量约49×103的nCLU在转录后修饰成相对分子质量约55×103有活性的nCLU，在细胞核集中，并诱导细胞凋亡［6］。CLU在肿瘤中的具体作用机制还不明确，Sonn等［7］合成纯化CLU，研究其在自然杀伤细胞中的作用。为了探讨CLU在肺癌中的作用，本研究采用纯化的sCLU体外处理肺癌细胞株，探讨sCLU对肺癌细胞株的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

细胞培养液DMEM以及胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)购自美国Hyclone公司；CCK8购自Invitrogen公司；Boyden Chamber小室购自上海易佰聚经贸有限公司；质粒小抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自德国Qiagen公司；LipofecamineTM2000、optiDMEM和总RNA提取试剂TRIzol购自美国Invitrogen公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、高保真酶PrimeStarTM、RNA反转试剂盒PrimeScriptTMRT Kit均购自宝生物工程(大连)有限公司。兔抗人Clusterin抗体购自美国Santa Cruz公司；低分子量蛋白marker购自上海Sangon公司；MicroRNA表达试剂盒购自广州锐博公司。

1.2 细胞、质粒菌株及细胞培养

人肺癌H460、A549细胞、大肠杆菌DH5α、质粒pRAG5-flag、HEK-293F细胞由上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室保藏，肺癌细胞均用含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养，取处于对数生长期的细胞用于实验。

1.3 真核表达纯化sCLU

利用人肺癌细胞中提取的RNA逆转录得到cDNA，以此为模板，进行PCR实验，产物回收构建真核表达载体，将构建的载体转入大肠杆菌DH5α，涂在含氨苄青霉素(ampicillin)的LB平皿上，次日选取单克隆菌落置于培养液中，在摇床中扩增，提取质粒后进行酶切鉴定，随后测序鉴定，得到正确的序列则进采用质粒提取试剂盒抽提质粒。将构建的质粒转染293F细胞得到目的蛋白，利用Flag抗体及CLU抗体进行纯化，鉴定得到纯化的sCLU。

1.4 Boyden小室试验

实验分BSA对照组和sCLU处理组，采用Boyden小室试验检测牛血清蛋白BSA对照组及sCLU处理组H460/A549细胞的迁移能力，首先Boyden小室上、下室之间用孔径8 μm的聚碳酸酯膜分开，上室加入含5.4 μmol/L的sCLU及肺癌细胞H460/A549(5×105个/mL)的无血清培养基400 μL/室，下室加含有5.4 μmol/L的sCLU完全培养基，细胞培养24 h后，取出小室，用棉签擦去上室未穿膜的细胞；用4%甲醛溶液固定黏附到滤膜下室面的细胞，苏木精染色，梯度乙醇溶液逐级脱水，邻苯二甲醛透明后，置于载玻片上封固。在光学显微镜下随机计数5个视野(×100)下的穿膜细胞数，以穿过滤膜的细胞数表示细胞的迁移能力，实验重复4次。

1.5 CCK-8 法检测sCLU对H460/A549细胞增殖的影响

取对数生长期的H460及A549细胞，0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，以2×104个/mL的细胞密度接种于96孔板中，100 μL/孔。细胞培养过夜后分别加入终浓度为5.4 μmol/L的sCLU或者BSA培养基，细胞继续培养，每天进行CCK-8检测，即吸出上清液，加入基础培养液100 μL/孔(其中含10 μL/孔的CCK-8液)；3 h后，在酶联免疫检测仪上检测波长为450 nm处各孔的吸光度(A)值，收集7 d结果计算细胞生长曲线。

1.6 sCLU处理H460细胞microRNA表达谱分析

以5.4 μmol/L浓度sCLU处理H460细胞48 h，收集RNA，委托上海康成公司进行microRNA表达谱分析，并进行生物信息学分析。

1.7 实时荧光定量PCR 检测分泌型Clusterin处理组H460细胞中microRNA的表达

用TRIzol试剂提取sCLU处理组H460细胞总RNA，随后利用广州锐博公司定量PCR检测microRNA表达试剂盒分析。大致如下，取50 ng总RNA加入锐博公司提供的反转录引物，利用反转录酶进行反转录，反转录反应体积为20 μL，反应条件：16 ℃30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 10 min。荧光定量PCR反应体系中主要包含2×SYBR Green Real-timePCR Master Mix及锐博公司提供的microRNA特异引物，在ABI 7900实时荧光定量PCR仪上进行。反应条件：95 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s、62 ℃ 60 s ，共40个循环。在62 ℃检测荧光强度，结果分析采用2－ΔΔCt方法：ΔΔCt＝实验组(Ct microRNA－Ct U6)-对照组(Ct microRNA-Ct U6)。每组实验重复3次。

1.8 统计学处理

通过SPSS 16.0统计软件对数据进行分析，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 真核表达纯化sCLU

在人肺癌细胞系H460的cDNA文库中利用引物进行PCR实验，成功构建了sCLU真核表达质粒，将其转染进293F细胞7 d后收集培养上清液，取上清液进行sCLU抗体纯化，最后利用特异型抗体进行验证，发现均可被FlAG标签抗体识别，证明是我们所需要的sCLU。

2.2 sCLU促进H460细胞迁移

在sCLU浓度为5.4 μmol/L情况下，检测sCLU对肺癌细胞株H460细胞迁移能力的影响，发现sCLU能够促进细胞迁移(图1)，sCLU处理组迁移的细胞是BSA对照组的3.10倍。

2.3 sCLU促进A549细胞迁移

为了进一步检测sCLU的功能，我们还在A549细胞中检验了sCLU对细胞迁移的影响，发现sCLU同样能够促进细胞迁移，sCLU处理组迁移的细胞是BSA对照组的3.44倍(图2)。

2.4 sCLU抑制肺癌细胞株H460/A549的生长

研究结果显示，sCLU抑制肺癌细胞株H460/A549细胞的生长(图3)。

2.5 sCLU对H460细胞的microRNA表达谱

本研究利用芯片探查了microRNA相关的分子机制。首先收集了sCLU处理的H460细胞，抽提RNA，然后进行microRNA表达谱芯片的检查和生物信息学分析，取得结果后使用定量PCR技术进行验证(图4A)。根据芯片结果，sCLU与BSA处理H460细胞中microRNA表达具有明显的相关性(图4B)，主要分布于对称轴附近，但较多的microRNA被sCLU诱导高表达(位于对角线平行两条斜线之外)，因此高表达microRNA是研究的目标。根据芯片分析，本研究选择了8个microRNA作为备选的microRNA(图4C)。

2.6 sCLU引起microRNA表达变化

根据芯片提示，本研究使用定量PCR方法，对目标microRNA表达变化进行检测，发现我们确定的8个目标microRNA，其中3个microRNA表达，而且与BSA处理的样本差异有统计学意义(图5)。

图 1 sCLU促进H460细胞迁移Fig. 1 sCLU promoted migration in H460

图 2 sCLU促进A590细胞迁移Fig. 2 sCLU promoted migration in A549

图 3 sCLU抑制H460/A549细胞生长Fig. 3 sCLU (secretory clusterin) inhibited the growth of lung cancer cells

图 4 sCLU处理组H460细胞的microRNA表达谱式分析Fig. 4 The analysis of microRNA expression spectrum in H460 treated with secretory clusterin

图 5 microRNA-302b-3p、microRNA-23a-5p和microRNA-101-5p高表达Fig. 5 microRNA-302b-3p, microRNA-23a-5p and microRNA-101-5p overexpressed in H460

3 讨 论

本研究前期的实验证明上调nCLU的表达具有明显抑制肿瘤增殖的作用，并且可以使细胞的运动迁移和侵袭能力明显减弱。Bettuzzi等［8］认为sCLU对于肿瘤细胞的生长、增殖没有作用，而Matsuda等［9］的研究显示sCLU能降解细胞基质，可作为Ⅵ膜型基质金属蛋白酶(membrane-type 6 matrix metalloproteinase，MT6-MMP)的负性调节因子，对于肿瘤的侵袭起到重要的作用。

本研究结果显示，在肺癌细胞A549中，sCLU处理组迁移的细胞是BSA对照组的3.44倍；在肺癌细胞H460中，则是BSA对照组的3.10倍。因此可以得出sCLU对于肺癌细胞的迁移同样存在促进作用。随后CCK-8检测结果也显示sCLU抑制肺癌细胞的生长。

蛋白组学在癌症的研究中起到重要作用［10］，microRNA是其中的一种方法，越来越多的研究表明，microRNA通过与靶基因的相互作用，调控人类至少1/3基因的表达，在生理和病理过程中有重要作用［11］，生物芯片技术是20世纪90年代初发展起来的新技术，具有高通量、高集成、微型化、连续化和自动化的特点，此技术现已成熟运用到mRNA 水平基因表达检测上，是检测细胞或组合microRNA表达谱的理想方法［12］。sCLU在肺癌细胞中具有明显的功能，但其分子机制还不清楚，本研究利用芯片技术探查了microRNA的分子。结果显示部分microRNA可能参与了肺癌发生的分子机制。对于microRNA，Liu等［13］在肺腺癌中发现MicroRNA-449a能够增强放疗的敏感性。Miao等［14］发现microRNA-449c能抑制非小细胞肺癌的进展。Kuo等［15］发现MicroRNA-33a可作为肺癌中骨转移的抑制因子。本研究中发现高表达的microRNA可能通过某些特殊机制与sCLU相互作用，为后续研究提供了重要的依据。

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The study of secretory clusterin on the biological behaviors of non-small cell lung cancer cells

MA Xiao1, LUO Xiao-ying2, LI Zong-hai2, LI He-cheng1(1.Department of Thoracic Surgery, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2.Shanghai Cancer Institute, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200032, China)

LI He-cheng E-mail: lihecheng2000@hotmail.com

Background and purpose: Primary study showed that clusterin was associated with tumorigenicity. The goal of the study is to investigate the role of secretory clusterin in non-small cell lung cancer cell A549/H460. Methods: The lung cancer cell A549/H460 was treated with purified secretory clusterin, the Boyden Chamber migration assay was used to detected the migration of the lung cancer cell; the CCK8 assay was used to detected the growth of the cells; microRNA expression spectrum in H460 treated with secretory clusterin was analyzed, after that, we used the real-time florescence quantification detected the expression of microRNA in H460, and the biological function of microRNA molecular mechanisms of secretory clusterin was analyzed. Results: Secretory clusterin promoted the migration in A549/H460 (P＜0.000 1); Secretory clusterin inhibited the growth in H460/A549 (P＜0.000 1); MicroRNA-302b-3p, microRNA-23a-5p and microRNA-101-5p was overexpressed in H460 when treated with secretory clusterin. Conclusion: Secretory clusterin could promote the migration and inhibit the growth of lung cancer cell；It could change the microRNA expression spectrum as well. Our studies revealed that secretory clusterin could be used as a tool for further study, and it is a potential target in the treatment of lung cancer.

Secretory clusterin; Non-small cell lung cancer; Cell migration; MicroRNA

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.09.001

R734.2

：A

：1007-3639(2013)09-0697-06

2013-05-07

2013-07-17）

国家自然科学基金项目(No：81272608)；上海市科技启明星跟踪计划(No：11QH1400600)。

李鹤成 E-mail:lihecheng2000@hotmail.com