长期递增负荷运动中骨髓和胸腺趋化因子CCR9、CCL25的应答性特征

张 琳， 郝选明

（华南师范大学体育科学学院，广东广州510631）

长期递增负荷运动中骨髓和胸腺趋化因子CCR9、CCL25的应答性特征

张 琳， 郝选明

（华南师范大学体育科学学院，广东广州510631）

目的：研究对骨髓和胸腺细胞具有归巢作用的趋化因子受体CCR9和配体CCL25在长期递增负荷运动中的应答性特征，探讨长期运动影响T细胞发育的调节机制。方法：将SD大鼠随机分为运动组和对照组，运动组进行递增负荷跑台训练6周，每周6次，每天30 m in。第1周运动负荷为10 m.m in-1，第2周为20 m.m in-1，此后每周增加5 m.m in-1，至6周时达40 m.m in-1。分别于第0、2、4、6周末，利用ELISA技术测定安静状态、运动后即刻和运动后3 h骨髓和胸腺中CCR9和CCL25表达水平。结果：骨髓和胸腺中的CCR9、CCL25呈现几乎相反的应答性变化。结论：随着递增负荷运动的进程，骨髓中的趋化因子受体CCR9和配体CCL25总体水平越来越高，且越来越难以恢复，表明骨髓归巢因子信号需求越来越强；而胸腺CCR9、CCL25总体水平越来越低，越来越难恢复，表明胸腺微环境紊乱程度越来越高。这应是受长期递增负荷运动影响，T细胞归巢及发育受阻且功能逐步下降的重要机理之一。

递增负荷运动；运动性免疫抑制；趋化因子；骨髓；胸腺；免疫调节

Author’s addressSchool of Physical Education&Sports Science，South China Normal University，Guangzhou 510631，Guangdong Province，China

T细胞在胸腺增殖分化和成熟，但胸腺细胞没有自我更新能力，因此，骨髓中的造血祖细胞需要归巢于胸腺才能维持T细胞的发育。祖细胞从骨髓归巢入胸腺的过程类似于成熟白细胞的归巢，包括选择素介导对脉管内皮的弱黏附，再通过整合素的强黏附，以及祖细胞渗出［1-2］。这些一系列定向的、协调有序的归巢事件需要细胞间相互作用以及多种因子的参与［3］，其中选择素介导对脉管内皮的弱黏附过程必须伴随趋化因子信号。CC趋化因子配体25（CC chemokine ligand 25，CCL25）是新近发现的CC趋化因子家族成员。已有研究结果显示，趋化因子CCL25及其受体CC趋化因子受体9（CC chemokine receptor 9，CCR9）参与骨髓T前体细胞归巢入胸腺［4］，以及未成熟胸腺细胞在胸腺基质中的迁移［5］。本实验对这些具有归巢作用的趋化因子进行研究，观察它们在6周递增负荷运动中应答与恢复特征，为运动性免疫抑制的调节机制提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验对象 8周龄雄性SD大鼠128只（购自广东中医药大学实验动物中心，许可证号为粤SCXK2008-0020，No.0043379，粤 监 证 字F2008A002），随机将其分为对照组和实验组。对照组32只，正常喂养，不进行运动干预，分别于第0、2、4、6周（WK0、WK2、WK4和WK6）取样，测试相同指标，用于判别大鼠生长对各指标的影响。实验组96只进行6周递增负荷跑台运动训练。

1.2 运动训练与取样 递增负荷跑台训练6周，每周6 d，每天1次，每次30 min。第1周运动负荷为10 m·min-1，第2周为20 m·min-1，随后，每周递增负荷增量5 m·min-1，至第6周，达到40 m·min-1最大负荷强度。取样时间：第0周，即未经训练的大鼠于安静状态（A）、一次性运动（10 m·min-1，30 m in）后即刻（J）及运动3 h取样；第2、4、6周，每周最后一次训练完成后48 h取样，取样日进行与上周相同负荷的跑台运动，分别在安静状态（A）、运动后即刻（J）、运动后3 h（3 h），无菌取大鼠骨髓和胸腺。

1.3 测试指标及方法 运用ELISA方法测定归巢因子骨髓和胸腺CCL25、CCR9水平，ELISA试剂购自武汉华美公司，严格按照试剂盒说明操作。

1.4 统计学处理 所有数据用平均数±标准差（X—± SD）表示，用PASW Statistics 17.0统计软件进行统计处理；组间比较采用单因素方差（one-way ANOVA）分析，P＜0.05为差异具有显著性的统计学意义。

2 实验结果

2.1 各周对照组骨髓、胸腺组织CCR9、CCL25的变化状态（图1） 实验结果表明，各对照组（C组）骨髓和胸腺组织中的CCR9、CCL25各周之间无显著性差异（P＞0.05），可以认为6周生长对这些指标无显著影响。以下主要探讨各周各组对运动训练的应答性特征。

图1 各周对照组骨髓、胸腺组织CCR9、CCL25的变化情况Figure 1. Changes of CCR9 and CCL25 in Bone Marrow and Thymus of Control Group in Different Weeks

图2 骨髓CCR9各周应答性变化情况Figure 2. Response of CCR9 in Bone Marrow in Different Weeks

图3 胸腺CCR9各周应答性变化情况Figure 3. Response of CCR9 in Thymus in Different Weeks

2.2 骨髓、胸腺组织CCR9的应答性变化（图2、图3）大鼠在6周递增负荷的跑台训练中，骨髓和胸腺中的CCR9呈现几乎相反的应答性变化：负荷初次应答的第0周，以及第2周末和第4周末运动即刻均明显上升，恢复3 h下降，呈倒“V”型应答曲线；第6周末，则在运动后呈持续升高趋势。在递增负荷的不同阶段它们的应答幅度也不同：第0周J组大鼠骨髓CCR9含量与A组相比上升（P＜0.05），运动后3 h组下降，略高于A组（P＞0.05）；第0周J组大鼠胸腺组织CCR9含量与A组相比下降（P＜0.01），运动后3 h组恢复。各运动组在第2周、4周骨髓CCR9含量均高于A组（P＜0.05或P＜0.01），其中第2周和第4周J组与A组比较均显著性上升（P＜0.01），3 h组与J组相比下降（P＜0.01），但均高于A组。J组、3 h组在第2周、4周胸腺CCR9含量低于A组（P＜0.01），3 h组与J组相比上升（P＜0.01），但均低于A组。在第6周各运动组骨髓CCR9含量高于A组（P＜0.01），且3 h组仍高于J组（P＞0.05）；在第6周各运动组胸腺CCR9含量均低于A组（P＜0.01），且3 h组仍低于J组（P＞0.05）。

2.3 骨髓、胸腺组织CCL25的应答性变化（图4、图5）

图4 骨髓CCL25各周应答性变化情况Figure 4. Response of CCL25 in Bone Marrow in Different Weeks

图5 胸腺CCL25各周应答性变化情况Figure 5. Response of CCL25 in Thymus in Different Weeks

大鼠在6周递增负荷的跑台训练中，CCL25的应答性特征与CCR9相似，在递增负荷的不同阶段它们的应答幅度也不同：第0周J组大鼠骨髓CCL25含量与A组相比上升（P＜0.05），运动后3 h组略高于对照组，但无显著性意义（P＞0.05）；第0周J组大鼠胸腺组织CCL25含量与A组相比下降（P＜0.01），运动后3 h组高于J组（P＞0.05），但低于A组（P＞0.05）。J组骨髓CCL25含量在第2、4周高于A组（P＜0.05或P＜0.01），3 h组与J组相比下降。J组胸腺CCL25含量在第2、4周低于A组（P＜0.05或P＜0.01），3 h组与J组相比上升。在第6周J组骨髓CCL25含量高于A组（P＜0.05），且3 h组仍高于J组（P＞0.05）；在第6周J组胸腺CCL25含量低于A组（P＜0.05），3 h组与J组相比无显著性差异（P＞0.05）。

3 分析与讨论

骨髓T细胞前体归巢入胸腺以及胸腺细胞在胸腺不同区域的迁移过程中，趋化因子及其受体表达起重要的调节作用。虽然多种骨髓细胞有T谱系分化潜能，但表达CCR9的亚群优先归巢入胸腺。其中，造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）缺乏表面表达CCR9，不能归巢入胸腺；而多能祖细胞（multipotent progenitors，MPPs）和共同淋巴样祖细胞（common lymphoid progenitors，CLPs）2种亚型的表面表达CCR9，能优先地归巢入胸腺。CCL25能够诱导骨髓细胞亚群、胎儿血前胸腺细胞和新生儿胸腺祖细胞归巢和定植于胸腺，阻断CCL25致使祖细胞进入胎儿胸腺减少［6］。

另外，CCL25可通过CCR9传递胸腺细胞的发育和迁移信号，促进胸腺细胞的发育和成熟。L.Carramolino等［7］研究报道，胸腺中的CCR9正常情况下主要表达于CD4-CD8-T双阴性（double-negative，DN）细胞、CD4+CD8+T双阳性（double-positive，DP）细胞及CD8+T单阳性（single-positive，SP）细胞。当DN和DP细胞上的CCR9与CCL25相互作用后，CCL25诱导细胞Ca2+的移动从而促进其向胸腺趋化运动，这些细胞在胸腺先后经历阳性选择和阴性选择后，主要分化发育成为CD4+T和CD8+T单阳性T细胞，随后CCR9在CD4+T细胞上的表达大量减少，而在CD8+T细胞的表达基本不变，表明胸腺CCR9、CCL25含量对T细胞亚群分化有较大程度影响。

为探讨运动性免疫抑制过程中CCR9、CCL25对骨髓祖细胞胸腺归巢的作用及胸腺细胞发育的调节机制，本研究选取骨髓和胸腺组织，初步研究了趋化因子CCL25、CCR9在骨髓和胸腺组织中的表达规律。从实验结果来看，CCL25、CCR9在骨髓和胸腺组织中均有表达，6周递增负荷跑台运动过程中，骨髓和胸腺中CCR9、CCL25呈现不同的应答趋势：骨髓中CCR9、CCL25呈现先上升再回落的倒“V”型曲线，而胸腺中CCR9、CCL25呈现先下降再回升的“V”型曲线。在递增负荷的不同阶段，CCR9、CCL25应答幅度不同：其中第0周运动后即刻骨髓中CCR9、CCL25水平升高，而胸腺中的水平下降，表明CCR9、CCL25对运动负荷应答非常敏感，一次性运动即可引起骨髓中趋化因子及其受体的升高而胸腺水平下降。第2周时应答幅度最大，运动后即刻组骨髓中CCR9、CCL25显著性升高，而在胸腺中显著性下降。第4周时应答幅度最大，运动组骨髓CCR9、CCL25与第2周相比显著性下降，但仍高于第0周水平；胸腺CCR9、CCL25水平与第2周相比显著性升高。第6周运动组骨髓CCR9、CCL25显著性上升，但在胸腺再次下降。在前4周运动组中，胸腺CCR9、CCL25水平在3 h组均有所恢复，但在第6周没有恢复的趋势。这表明随着免疫抑制的进程，胸腺CCR9、CCL25水平逐渐下降。

胸腺CCR9、CCL25水平逐渐下降趋势可能会影响胸腺细胞的发育进程，其机制可能是：胸腺CCR9、CCL25水平下降，不能维持未成熟DN细胞在胸腺不同位置的迁移，DN细胞不能准确、及时地迁移进入促使其发育的胸腺部位，使DN细胞无法获得有效的胸腺微环境，胸腺DN细胞的分化增殖异常，继而抑制下游DP双阳性细胞的扩增，产生更强的分化抑制效应，导致SP单阳性细胞亚群数量下降，比例失衡。由上述结果可推测，胸腺CCR9、CCL25水平下降可能是胸腺细胞发育受损的重要因素。

骨髓CCR9、CCL25的动态变化规律与胸腺相反，在递增负荷运动过程中也出现了波动，呈现先上升再回落的倒“V”型曲线，最终随免疫抑制程度的加深而上升。其机制一方面可能是由于胸腺结构持续性破坏，胸腺萎缩和胸腺祖细胞在运动性免疫抑制过程中逐渐减少，需要更多的骨髓祖细胞归巢入胸腺，机体在运动应激过程中，尽力维持其稳态，相应地加强了上游骨髓趋化因子的需求信号，胸腺部位趋化因子越缺乏，骨髓信号越强。另一方面，在病理研究中，有报道CCR9、CCL25的表达与淋巴细胞的募集相关，而且它们在疾病发生时的高表达很可能与疾病发生时免疫细胞对其他组织和系统的迁移、浸润密切相关。CCR9的活化能够提供细胞存活的信号，从而有可能增强病理细胞的生存和增殖能力［8］，因而有可能是一种病情加重的信号；因此，在骨髓中CCR9、CCL25的表达随免疫抑制加剧而表达量增加的机制及其生物学意义有待进一步研究。

4 小结

CCR9和CCL25的应答性变化与递增负荷运动的进程有关。骨髓中CCR9和CCL25的上升可能是由于胸腺持续性破坏，机体为尽力维持其稳态而加强了上游骨髓归巢因子的需求信号。胸腺CCR9和CCL25下降可能导致胸腺微环境紊乱，从而影响胸腺细胞发育。

随着递增负荷运动的进程，骨髓中的趋化因子受体CCR9和配体CCL25总体水平越来越高，且越来越难以恢复，表明骨髓归巢因子信号需求越来越强。

在胸腺中趋化因子受体CCR9和配体CCL25总体水平越来越低，恢复也越来越难，表明胸腺微环境紊乱程度越来越大。

胸腺微环境的破坏，归巢因子作用的减弱，应是受长期递增负荷运动影响，T细胞归巢及发育受阻且功能逐步下降的重要机理之一。

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Responsive Characteristics of Chemotactic Factors CCR9/CCL25 in Bone M arrow and Thymus during Long-Term Incremental Exercise

∥ZHANG Lin，HAO Xuanming

Objectives：It is to observe the responsive characteristics of CCR9/CCL25，the two chemotactic factors in bone marrow and thymus during long-term incremental exercise and to explore the regulative mechanism of T lymphocyte development with long-term exercise.Methods：Sprague-Dawle rats were randomly divided into control and exercise group.Exercise protocol：treadmill exercise，successive 6 weeks，6 days per week，30 minutes per day，10 m·m in-1in week 1，20 m·m in-1in week 2，with 5 m·m in-1increment in the following weeks till it reached 40m·min-1in the 6thweek.Samples were taken before exercise，at rest，immediately after exercise and 3 hours after exercise，respectively at the end of week 2，4 and 6.CCR9/CCL25 was tested by ELISA.Results：CCR9/CCL25 in bone marrow and thymus presented almost opposite responsive pattern during 6-week incremental exercise. Conclusions：There is an increasing grow th for CCR9/CCL25 level in bone thymus and more difficulty of recovery during the incremental exercise，which means an increasing grow th of demands for chemotactic factors in bone marrow.On the other hand，a decreasing grow th for CCR9/CCL25 level in thymus and more difficulty of recovery show the increasingly big disorder for thymus micro-environment.It should be one of the important mechanisms for T lymphocyte development impairment and gradually downgrading function with long-term incremental exercise.

incremental exercise；mobility immune suppression；chemotactic factor；bone marrow；thymus；immune regulation

G804

A

1000 -5498（2013）03 -0056 -04

2012 -10 -20；

2013 -02 -06

中国博士后科学基金资助项目（20110490909）；广东省自然科学基金资助项目（S2011040003164，9151063101000059）

张琳（1971 -），女，河南南阳人，华南师范大学博士后；Tel：13660106216，E- mail：sdtyzl@yahoo.cn

郝选明（1954 -），男，陕西韩城人，华南师范大学教授，博士，博士生导师；Tel：（020）85211498，E- mail：hxm@scnu.edu.cn