早期断奶对仔猪小肠碱性磷酸酯酶活力的影响

王秋菊崔一喆*孙 鹏朱 双

(1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319;2.黑龙江省农垦总局北安分局龙门农场，五大连池 164145)

小肠碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase，AKP)在细胞分化、致病菌脂多糖内毒素的解毒、维持内腔pH，组织内磷酸盐消化和脂肪吸收等方面起重要作用。AKP是细胞分化作用酶，是小肠肠道消化和吸收功能发生改变的标志酶［1］。小肠AKP的生理功能包括水解磷酸盐［2］、跨细胞溶质运输［3］以及参与脂肪的吸收［4］等。最近，有研究显示小肠AKP能够增加碳酸氢盐分泌进肠道的活力，从而允许酸性的胃的消化物被中和后进入小肠，给小肠AKP活力的发挥创建有利条件［5］。同样，人们也认识到了小肠AKP作为内源的解毒因子对肠道黏膜免受致病菌脂多糖危害的防御功能［6－7］，并且这个功能靠肠内营养维持着［8］。因此，理解断奶仔猪小肠AKP消化能力以及细胞内AKP含量的变化将会增进肠道生理学的知识，同时为提高保育期仔猪营养和生长提供理论基础。

尽管出生后发育和4～6周龄断奶仔猪体内的AKP活力变化已经被报道过［9］，但关于小肠细胞内AKP活力和含量的研究还未见报道。因此，本试验旨在研究早期断奶对仔猪小肠和小肠细胞内AKP活力的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物分组与饲养管理

试验于2010年5月在黑龙江省齐齐哈尔市养猪示范基地进行。选取10日龄、体重［(4.48±0.26)kg］相近的“杜×长 ×大”三元杂交仔猪40头(分别由40头母猪生产)，随机分为2组，每组20个重复，每个重复1头仔猪，2组仔猪分别以随母猪哺乳和早期断奶方式饲养。试验期10 d。

哺乳仔猪:在哺乳仔猪舍，随母猪继续哺乳10 d;断奶仔猪:在保育仔猪舍饲养，饲喂玉米－豆粕型商业断奶饲粮10 d，每天07:00、12:00和17:00共饲喂3次，自由饮水。饲粮营养水平参考NRC(1998)，断奶饲粮组成及营养水平见表1。

断奶仔猪猪舍为封闭式，通风良好，水泥地面;采用单栏隔离饲养，每栏1头仔猪;栏内一角上方距地面0.8 m处悬挂红外取暖灯，灯下地面铺1块0.5 m×1 m的吸热板，以保证仔猪温暖。

表1 断奶饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table1 Composition and nutrient levels of the weaner diet(DM basis) %

1.2 试验样品采集与处理

饲养试验结束后第1天清晨，从各组中随机选取12头仔猪，共计24头。屠宰后，打开仔猪腹腔，将十二指肠悬韧带到小肠远端的全部小肠都取出，立即用冰生理盐水冲洗小肠内部。将各段小肠分别称鲜重，并从每部分的中间段取样，装到样品收集管中暂时用液氮冷冻保存［10］。冷冻后的肠段样品，用研钵在液氮存在的条件下研磨成粉末状，－80℃冷冻保存。

1.3 样品制备

组织匀浆:称取约1.3 g粉末状的冷冻的小肠组织样品，按照1 g样品20 mL匀浆缓冲液的比例，用冷藏的含有蛋白酶抑制剂的匀浆缓冲液将样品解冻，并用多层匀浆仪将样品匀浆。匀浆时，每个样品16 000 r/min匀浆3 min，且每隔1 min，停顿20 s。匀浆后的样品，称量并记录匀浆液的总体积，取2 mL匀浆液样品于－80℃超低温冷冻保存。

细胞内质:根据 Mei等［11］的试验方法，采用Mg2+－沉淀反应和4℃差异离心的方法制备细胞内质样品。具体为组织匀浆液于4℃、2 000×g离心15 min。上清液用1 mol/L MgCl2溶液混合，并将离心管平铺在冰上，放入水浴振荡器，低速振荡15 min，使得混合液中 MgCl2终浓度为10 mmol/L。将混合液于 4℃、2 400×g离心15 min。丢弃上层泡沫层，上清液即为细胞内质样品。称量细胞内质样品总体积，并从中取2 mL样品于－80℃冷冻保存。

细胞顶膜:将余下的细胞内质样品分装于真空超速低温离心机专用离心管中，用含有10 mmol/L MgCl2的重悬浮缓冲液平衡各离心管质量，使得各离心管质量之差小于0.001 g，达到平衡。于4℃、19 000×g真空超速离心30 min。吸取上清液，得到的沉淀即为粗制的细胞顶膜样品。将沉淀用重悬浮缓冲液重新悬浮到距离离心管管口5 cm处，重新平衡各离心管的质量，于4℃、39 000×g真空离心30 min，沉淀为目的细胞顶膜样品。将沉淀用悬浮缓冲液重新悬浮成0.5 mL细胞顶膜悬浮液，全部于 －80℃冷冻保存。

1.4 小肠AKP活力的测定

1.4.1 制备标准曲线

采用对硝基苯酚反应测定小肠AKP的活力。首先制备2.5 mmol/L对硝基苯酚标准贮存液，并分别 稀 释 为 0.521、1.042、3.125、6.250 和10.417 μmol/L的磷酸对硝基苯酚底物溶液。然后用0.25 mol/L NaOH溶液分别稀释6个梯度的标准品测定液，各标准品管硝基苯酚终浓度为0、6、40、60、90 和120 nmol/L。每个标准浓度做3 个平行。吸取标准溶液到比色皿中，在分光光度计400 nm读取吸光度值，制作标准曲线。

1.4.2 样品测定

用已制得的小肠组织匀浆、细胞内质和细胞顶膜样品，根据其蛋白质含量，将样品稀释至蛋白质浓度为1.0 mg/mL，用于AKP活力的测定。具体步骤为:每个样品做3个平行，移取80 μL稀释样品溶液到每个试管中，并放在装有冰的盒子内预冷。在每个试管中分别加入1.920 mL底物溶液，涡旋混合均匀，37℃水浴孵育样品20 min。孵育结束后，在每个试管中加 2 mL 0.5 mol/L NaOH溶液并涡旋混合均匀，停止反应。同时做空白对照，在每个空白试验管中加入2 mL 0.5 mol/L NaOH溶液，再加入80 μL样品。将所有试管于1 500 r/min离心10 min，以沉淀蛋白质。吸取上清液到比色皿中，用紫外分光光度计在400 nm处读取吸光度值。

AKP活力单位定义为:37℃每分钟催化产生1 μmol对硝基苯酚的酶量(mg prot)为1个活力单位。

测定结果根据米－门二氏方程式酶动力学基本方程式，通过Fig.P曲线拟合程序获得AKP活力的动力学参数估计。米氏常数(Km)为最大酶活力(Vmax)达到1/2时，酶作用底物的浓度;Km越大，酶亲和力越小。小肠各肠段AKP的消化能力(Vcap)根据Weis等［12］的公式进行计算。

式中，Vcap为某一肠段AKP的消化能力［mol/(kg BW·d)］，Vmax为该肠段的AKP最大酶活力［μmol/(mg prot·min)］，W 为该肠段的鲜重(g)，P为该肠段的蛋白质含量(mg prot/g，鲜重基础)，BW为仔猪的体重(kg)。

1.5 小肠AKP相对含量的测定

1.5.1 总蛋白质含量的测定

根据Bradford分析方法，使用牛血清蛋白(级分IV)作为标准品，测定组织匀浆、细胞内质和细胞顶膜样品中总蛋白质的含量。

1.5.2 免疫印迹(Western-blot)法

制得蛋白质含量为1 μg/μL的样品，以β－肌动蛋白为内参，进行Western-blot。小肠AKP一抗用兔抗人多克隆抗体，1∶15 000稀释;β－肌动蛋白一抗用鼠抗人单克隆抗体，1∶20 000稀释;二抗均用兔抗人免疫球蛋白G，1∶20 000稀释。

1.6 数据统计分析

试验数据采用SAS 9.0软件中one-way ANOVA及t检验进行分析。以P＜0.05为差异显著。结果采用Fig.P曲线拟合软件绘制柱状图和曲线图。

2 结果

2.1 早期断奶对仔猪生长性能的影响

由表2可见，在10 d的饲养试验期间，断奶仔猪的平均日采食量为148.50 g/d，料重比为3.58，与哺乳仔猪相比，断奶仔猪的末重显著降低(P＜0.05)，同时断奶仔猪的平均日增重极显著低于哺乳仔猪(P＜0.01)。提示早期断奶对仔猪生长有极强的抑制作用。

表2 仔猪的生长性能Table 2 Growth performance of piglets(n=20)

2.2 早期断奶对仔猪小肠AKP活力的影响

由表3可见，与哺乳仔猪相比较，断奶仔猪十二指肠、空肠和回肠Km分别显著提高了27%、17%和6%(P＜0.05);断奶仔猪整个小肠 Km显著提高了17%(P＜0.05);表明断奶仔猪整个小肠和小肠各段的AKP亲和力均显著降低(P＜0.05)。

断奶仔猪十二指肠、空肠和回肠AKP最大酶活力较哺乳仔猪分别显著降低了26%、36%和26%(P＜0.05)，且整个小肠的AKP最大酶活力显著降低了30%(P＜0.05)。

与哺乳仔猪相比，断奶仔猪十二指肠、空肠和回肠的AKP消化能力分别显著降低了39%、22%和20%(P＜0.05)，整个小肠AKP消化能力显著降低了23%(P ＜0.05)。

小肠各肠段AKP活力动力学曲线如图1所示，可见哺乳仔猪各肠段AKP活力均高于断奶仔猪，且各肠段变化趋势一致。

表3 仔猪小肠各肠段AKP的Km、最大酶活力和消化能力Table 3 Km，maximal enzyme activity and digestive capacity of alkaline phosphatase in different segments of small intestine of piglets(n=72)

空肠AKP的消化能力约占整个小肠AKP消化能力的72%(表3)。因此，对空肠细胞内质和细胞顶膜中AKP消化能力进行了进一步的分析，观察AKP消化能力在空肠中的再分配。

由表4可见，断奶与哺乳仔猪相比较，空肠细胞内质和细胞顶膜AKP的Km分别显著提高了48%和49%(P＜0.05)，提示空肠细胞内质和细胞顶膜AKP的亲和力均显著降低(P＜0.05)。

断奶和哺乳仔猪空肠细胞顶膜AKP最大酶活力占空肠AKP最大酶活力的90%左右，断奶没有显著影响空肠细胞内质AKP的最大酶活力(P＞0.05)，而断奶仔猪空肠细胞顶膜AKP最大酶活力比哺乳仔猪显著降低了10%(P＜0.05)。

断奶和哺乳仔猪空肠细胞顶膜中AKP消化能力占空肠AKP消化能力的98%以上。与哺乳仔猪相比，断奶仔猪空肠AKP的消化能力在细胞内质和细胞顶膜中分别显著降低了17%和13%(P ＜0.05)。

由仔猪空肠细胞内质和细胞顶膜中AKP活力动力学曲线(图2)可见，断奶仔猪空肠细胞内质和细胞顶膜中AKP活力均低于哺乳仔猪，且随底物浓度增加，变化趋势一致。

图1 仔猪小肠AKP活力动力学曲线Fig.1 Kinetic curves of activity of small intestinal alkaline phosphatase of piglets

表4 仔猪空肠细胞内质和细胞顶膜AKP的Km、最大酶活力和消化能力Table 4 Km，maximal enzyme activity and digestive capacity of jejunal intracellular and cell apical membrane-bound alkaline phosphatase of piglets(n=72)

图2 仔猪空肠细胞内质和细胞顶膜中AKP活力动力学曲线Fig.2 Kinetic curves of activities of jejunal intracellular and cell apical membrane-bound alkaline phosphatases

2.3 早期断奶对仔猪空肠AKP相对含量的影响

由图3可见，从空肠组织匀浆、细胞内质和细胞顶膜中成功鉴定出60 ku的AKP。与哺乳仔猪相比，断奶仔猪空肠组织匀浆、细胞内质和细胞顶膜的AKP相对含量分别显著降低了48%、53%和64%(P ＜0.05)。

通过皮尔森相关性分析得到，哺乳和断奶仔猪空肠组织匀浆(r=0.51，P=0.023)、细胞内质(r=0.41，P=0.032)和细胞顶膜(r=0.52，P=0.020)的小肠AKP最大酶活力与相对含量均呈显著正相关。

图3 仔猪空肠组织匀浆、细胞内质和细胞顶膜中AKP相对含量Fig.3 Relative content of alkaline phosphatase in jejunal tissue homogenate，intracellular fraction and cell apical membrane of piglets(n=72)

3 讨论

断奶过程伴随着包括仔猪在内的多数哺乳动物幼仔的采食量下降［13］，且使幼仔经受营养和环境的双重压力［14］，因此与正常哺乳的幼仔相比，由于胃肠道未发育成熟，断奶导致仔猪生长性能降低。在试验究中，早期断奶仔猪显示出明显的断奶应激症状，断奶仔猪的平均日采食量为148.50 g/d，低 于 NRC(1998)饲 养 标 准 中240 g/d，断奶仔猪的平均日增重极显著低于同期哺乳组仔猪。Gu等［15］研究表明，哺乳动物新生儿在离开它们的母亲断奶时，遭受着巨大的肠道结构和功能的变化，直接影响到仔猪肠道的消化与吸收功能，进而影响仔猪的生长发育。

AKP被称为经典的非特异性金属酶二聚体。这些酶在自然界广泛存在于从细菌到哺乳动物的生物体中，存在于最基本的生命过程中。尽管AKP作用的生理机制仍然不明确，但无机磷酸盐缺乏会诱导许多物种产生AKP(尤其是原核生物)，并且在磷酸盐代谢中起重要作用。

大多数生物体中的AKP以二聚体的形式存在，它可以催化磷酸单酯水解生成无机磷酸盐和酒精。小肠AKP是一种可以水解磷酸酯的肠刷状缘蛋白，在解毒致病菌内毒素、保持肠腔pH、有机磷的消化和脂肪的吸收过程中发挥作用，其基因表达依赖肠上皮细胞分化。小肠AKP被认为是小肠消化和吸收功能发生变化的重要标记酶［16］。小肠AKP的生理功能包括水解磷酸酯［17］、溶质的跨细胞膜转运、参与脂肪的吸收［18－19］。作为肠黏膜内源性解毒因子，小肠AKP对于防御肠腔致病细菌内毒素中毒的作用已明确［20－21］，这种作用可以通过肠内营养来维持。Fan等［22］研究显示，仔猪肠上皮细胞在哺乳到19日龄时完全被替换掉，而空肠上皮细胞在新生仔猪中的生存期为10 d，仔猪出生后空肠AKP催化活力从哺乳到断奶呈降低趋势。但目前为止，关于断奶对小肠AKP活力影响的研究很少。

从本试验结果可以看出，空肠AKP消化能力占整个小肠AKP消化能力的72%，起主导作用;在空肠中，细胞顶膜AKP消化能力占空肠AKP消化能力的98%以上。与正常哺乳仔猪相比，早期断奶对小肠AKP最大酶活力、消化能力和酶亲和力都有显著影响，早期断奶显著地降低了仔猪整个小肠肠段AKP的最大酶活力和消化能力。本试验验证了早期断奶仔猪空肠中AKP消化能力、最大酶活力以及小肠AKP的亲和力降低，为早期断奶造成仔猪的易感性和阻碍生长做出理论解释，即断奶仔猪易感染肠道疾病的原因之一是空肠AKP的保护作用降低。

本试验的主要目的是研究早期断奶仔猪与哺乳仔猪小肠AKP活力的差异。结果显示，断奶显著降低了仔猪小肠AKP消化能力和空肠前端的AKP最大酶活力。目前关于断奶对小肠AKP活力和其基因表达影响的研究报道很少，本试验结果发现断奶仔猪小肠AKP最大酶活力和消化能力都降低，与Miller等［23］的研究结果相反，该研究结果显示3周龄和5周龄断奶的仔猪小肠AKP活力没有显著变化。2点原因可以解释为什么本试验与该研究结果不一致。第一，断奶时间不同，本试验仔猪在10日龄断奶10 d后测定，Miller等［23］的研究是在仔猪5周龄时断奶后5 d测定;第二，本试验测定了小肠AKP的最大酶活力，而Miller等［23］的研究中只用了一个 AKP的底物浓度(1.5 mmol/L)。因此，本试验测定的小肠AKP特定活力较Miller等［23］研究的最大酶活力低很多。图1和图2可以证明比最大酶活力低时测定的小肠AKP特定活力受到底物浓度的影响，而小肠AKP的消化能力和含量并不受底物浓度的影响。

Western-blot分析证实仔猪空肠前端细胞内质和细胞顶膜中的小肠AKP分子质量大约为60 ku，比人类肠道中的AKP分子质量小［24］。在新出生的小鼠空肠中检测到小肠AKP分子质量约为65 ku［25］。小鼠小肠AKP的编码mRNA的无细胞翻译产生2种小肠AKP单体，分子质量分别为62和65 ku［26］。理论上，空肠前端细胞内质和细胞顶膜中AKP的相对含量是小肠AKP生物合成和运输以及降解的净平衡［27］。哺乳和断奶仔猪，肠细胞顶膜的小肠AKP的最大酶活力大部分(98%)是空肠前段AKP的活力，暗示着在细胞中有很小的膜内AKP蛋白池。因此，早期断奶仔猪空肠前段AKP含量的下降主要是由于小肠AKP的蛋白质从头合成降低了，这仍需要从体外对小肠AKP进行标记和生物合成来继续研究和确定。另一方面，与早期断奶仔猪相比，哺乳仔猪的空肠前段AKP的亲和力也有显著变化。有研究显示，新出生仔猪空肠AKP亲和力从哺乳到断奶后期是逐渐降低的［23］。小肠AKP亲和力、最大酶活力和含量的在空肠前段的改变显示，早期断奶改变了小肠AKP的含量并降低了它的亲和力。这个小肠AKP亲和力的变化主要是由小肠AKP的糖基化的发生导致［22］。因此，空肠AKP最大酶活力和消化能力的降低是由小肠中AKP含量和亲和力降低的联合作用导致的。再者，已知新生儿在正常哺乳情况下，肠上皮细胞在出生19 d后完全更换，且新生儿空肠上皮细胞的寿命为10 d，可以推断，早期断奶通过影响肠上皮细胞更换过程中小肠AKP的蛋白质合成和转运来降低小肠AKP的消化能力。小肠AKP在肠道中有重要作用，包括解毒作用、维持腔内pH，消化有机磷酸盐和吸收脂肪，小肠AKP的消化能力、活力降低就会伴随着小肠AKP含量的降低，也就如本试验的结果所示。本试验结果为研究小肠中小肠AKP活力的调控机制提供了信息，也许可以用来解释早期断奶仔猪对肠道疾病和生长受阻易感性。

4 结论

总之，小肠AKP在小肠上皮黏膜中起重要作用，早期断奶可降低小肠AKP活力、亲和力、消化能力及含量，使仔猪承受腹泻和生长受阻的风险。

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