二烯丙基二硫通过活性氧介导的JNK信号通路诱导人白血病K562细胞凋亡

易 岚，谭 晖，吉晓霞，陈 歆，单 健，苏 琦

(南华大学1.肿瘤研究所、2.药学与生命科学学院，湖南衡阳 421001)

目前，激发或诱导肿瘤细胞凋亡已成为治疗肿瘤的新方法［1］。研究表明，众多的细胞因子和药物具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力［2］。其中，大蒜及其烯丙基硫化物的抗癌作用正日益受到关注。有研究显示［3］，大蒜主要有效成分二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)可诱导胃癌、肺癌、结肠癌等多种肿瘤细胞凋亡。我们前期工作已经证明，DADS不仅可诱导人结肠癌等细胞分化与凋亡［4］，而且可诱导人白血病细胞分化与凋亡。DADS对人白血病细胞具有双效作用，小剂量DADS(＜1.25 mg·L－1)诱导人白血病细胞分化，其机制与抑制 JAK1/STAT3的酪氨酸激酶活性、下调STAT3与Myc核内表达水平，提高组蛋白乙酰化水平及p21WAF1表达上调有关［5］。而中等剂量 DADS(＞1.25 mg·L－1)可诱导人白血病细胞凋亡，其机制与G2/M期阻滞，抑制ERK和激活p38，下调Bag-1、Bcl-2，上调Fas-L、Bax 等有关［6－7］。但具体机制尚不清楚。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)作为细胞内非常重要的信号分子参与了细胞凋亡的启动和执行［8］。最新研究表明，ROS与 MAPKs信号通路密切相关［9］。在许多肿瘤细胞的凋亡过程中，ROS是JNK信号通路的重要调节者［10］。尽管在DADS作用的肿瘤细胞中，ROS的水平有明显的上调，但ROS与其它信号分子在细胞凋亡过程中的相互作用仍不完全清楚。本研究旨在研究DADS通过ROS介导的JNK信号通路诱导人白血病K562细胞凋亡，进一步阐明白血病的发病机制，为白血病的诱导凋亡治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器DADS为Fluka公司产品，小牛血清是杭州四季青生物工程公司产品。蛋白质分子量标准(protein molecular weight marker)购于碧云天生物技术有限公司。BCA蛋白定量试剂盒为Pierce公司产品。2'，7'-二氯氢化荧光素二脂(DCFH-DA)为 Santa Cruz公司产品。N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)，JNK特异抑制剂sp600125购自Sigma公司。JNK抗体、phospho-JNK抗体以及相应的二抗均为Abcam Biotechnology公司产品。

1.2方法

1.2.1细胞培养 细胞培养采用常规培养，培养液为含10%小牛血清的RPMI 1640，在37℃，饱和湿度，5%CO2孵箱中培养，每3～4天换液传代。取对数生长期细胞用于实验，DADS用培养基稀释到所需浓度。

1.2.2MTT检测 用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种到96孔板，每孔体积100 μl，设3个复孔。加入处理因素并设0对照，空白对照(对照孔及调零孔加100 μl培养液)，溶酶对照和不同浓度DADS处理组。在37℃，饱和湿度，5%CO2孵箱中常规培养，继续培养72 h。于结束前4 h除0对照组外，每孔加MTT 溶液(5 g·L－1用 PBS 配制，pH=7.4)20 μl，继续孵育4 h，终止培养。离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150 μl DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解。于酶联免疫检测仪上测各孔吸光度，检测波长570 nm，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，按下列公式计算抑制率。

1.2.3凋亡细胞百分率检测 调整待测细胞的浓度为5 ×108－1 ×109·L－1。1 000 r·min－1，离心5 min，收集培养细胞，预冷PBS吹打重悬，离心沉淀，重复1次。用4℃预冷的75%乙醇固定细胞，冰盒送检。样本上机前离心洗涤，弃上清，加碘化丙啶(PI)50 μl，浓度为 1 g·L－1，振荡混匀，避光置冰箱30 min，上机检测时300目尼龙网滤过，随机计数10 000个细胞，进行DNA含量分析。DNA含量低于2n的细胞百分数为凋亡细胞百分率。

1.2.4细胞内ROS检测 收集细胞，用Hanks液洗涤细胞 2 次，加入终浓度为 10 μmol·L－1的DCFH-DA 400 μl，充分混匀，在 37℃条件下避光反应50 min，用Hanks液洗涤细胞3次以去除细胞外荧光剂，用500 μl Hanks液重悬细胞，37℃条件下水浴10 min.流式细胞仪分析荧光强度，激发波长488 nm，发射波长530 nm。

1.2.5Western blot检测 细胞裂解:分别收集未处理组、处理组细胞，冰PBS洗两次，以1×107个细胞浓度加入 100 ～150 μl裂解液(100 mmol·L－1NaCl，10 mmol·L－1Tris-HCl pH 7.6，1 mmol·L－1EDTA pH 8.0，1 mg·L－1Aprotinin，100 mg·L－1PMSF)，冰上裂解 1 h，12 000 r·min－1离心 10 min，吸出上清液，即为细胞总蛋白。根据Bradford法进行蛋白含量的测定。收集蛋白，变性后经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至PVDF膜上，用含5%牛血清白蛋白的TBST(Tris-HCl 20 mmol·L－1，NaCl 137 mmol·L－1含 0.1%Tween-20)封闭 1 h，用特异性一抗4℃孵育过夜，TBST洗3次，每次5 min，相应的二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，化学发光剂检测蛋白质印迹，薄层扫描仪测定印迹区带的光密度值。

1.3统计学处理采用SPSS 12.0统计分析软件，Student't-test法进行显著性检验，用Sigma plot 9.0软件进行绘图。

2 结果

2.1DADS对K562细胞的增殖抑制作用如Tab 1 所示，2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg·L－1DADS处理人白血病K562细胞，抑制率分别为32.48%、59.34%、66.42%、81.05%、87.09%，抑制率呈浓度依赖性增加(P＜0.05)。Tween80对照组对细胞增殖无明显抑制作用(P＞0.05)。这些结果表明，DADS以剂量依赖性抑制K562细胞的生长。IC50值在 5.0 mg·L－1左右。

Tab 1 The OD570value of different concentration DADS treated K562 cells 48 hours(±s)

Tab 1 The OD570value of different concentration DADS treated K562 cells 48 hours(±s)

DADS/mg·L－1 OD570value IR/%Control 1.027 ±0.0408 2.5 0.6892 ±0.0367 32.48 5.0 0.415 ±0.0115 59.34 10.0 0.3428 ±0.0262 66.42 20.0 0.1934 ±0.0099 81.05 40.0 0.1325 ±0.0085 87.09 Tween80 1.0020 ±0.0354 2.433

2.2DADS对K562细胞内ROS的影响DCFHDA染色后，流式细胞术检测结果如Fig 1所示，5 mg·L－1DADS 处理人白血病 K562 细胞 0、1、2、4、8、12和24 h后，细胞荧光强度分别为7.9±1.08、10.1±1.24、12.5 ±0.63、15.9 ±1.47、26.1 ±0.99、20.8±1.56、12.7 ±0.65。结果表明:5 mg·L－1DADS作用 K562细胞，ROS水平在1 h内迅速上升，8 h到达高峰，随后的4 h又开始下降。

Fig 1 FCM analysis of K562 cells treated with 5.0 mg·L －1 DADS for different lengths of time

2.3DADS诱导人白血病K562细胞凋亡过程中JNK1/2的活化在DADS诱导人白血病K562细胞凋亡过程中有激酶JNK1/2的活化。如Fig 2所示，在DADS诱导K562细胞凋亡过程中，磷酸化JNK1/2表达水平呈时间依赖性，5 mg·L－1DADS作用K562细胞4h后，与未处理组想比，磷酸化JNK1/2表达水平明显上升，8 h达到高峰，随后表达开始下降，这和检测到得ROS水平相一致。

Fig 2 Western blot analysis of JNK activation in K562 cells induced by different lengths of time with 5.0 mg·L －1DADS

2.4NAC和sp600125对DADS诱导K562细胞凋亡的影响如Fig 3所示，5 mg·L－1DADS作用K562细胞24 h，凋亡率为(38.6±2.12)%，与未处理组(3.2% ±0.76%)相比，5 mg·L－1DADS 能明显诱导K562细胞凋亡，而10 mmol·L－1抗氧化剂NAC 和 10 μmol·L－1JNK 抑制剂sp600125并未能诱导细胞凋亡。在10 mmol·L－1NAC或10 μmol·L－1sp600125预处理后再用5 mg·L－1DADS作用细胞24 h，凋亡率分别为(15.8±1.76)% 和(17.1±1.54)%，这些结果表明用 NAC和sp600125预处理细胞能阻滞DADS诱导K562细胞凋亡(P＜0.05)(Fig 4)。

Fig 3 Flow cytometry(FCM)analysis of apoptosis of K562 cells induced by 5 mg·L－1DADS，with and without pretreatment with 10 mmol·L －1NAC or 10 μmol·L －1sp600125

Fig 4 Flow cytometry(FCM)analysis of apoptosis rate of K562 cells

2.5NAC和sp600125对K562细胞p-JNK1/2表达的影响为了进一步研究JNK的活化与ROS的关系，我们在 DADS诱导细胞凋亡中应用了sp600125和NAC两种抑制剂来检测JNK的活化。Western blot分析结果如 Fig 5所示，在5 mg·L－1DADS作用30 min之前用sp600125或NAC预处理细胞，再用5 mg·L－1DADS作用8 h后，磷酸化JNK表达水平(尤其是磷酸化JNK1)表达水平明显下降。结果表明:在DADS诱导人白血病K562细胞凋亡过程中有激酶JNK1/2的活化与ROS密切相关。

Fig 5 Effects of pretreatment with NAC and sp600125 on p-JNK1/2 activation in DADS-treated K562 cells

3 讨论

刺激和诱导肿瘤细胞凋亡已经成为治疗肿瘤的一种新的可能性［11］。众多的细胞因子和药物都能诱导肿瘤细胞凋亡，其中，大蒜及其烯丙基硫化物的抗肿瘤作用已日益吸引着人们的目光。DADS作为大蒜提取物中最有效的成分，可以诱导多种肿瘤细胞包括人慢性髓细胞性白血病K562细胞系凋亡，但是其具体机制还有待于进一步研究。

我们前期工作已经表明，低剂量(1.25 mg·L－1)的 DADS具有抗增殖作用，能诱导人白血病K562细胞分化［12］。本研究用中等浓度(2.5～20 mg·L－1)DADS来诱导人白血病K562细胞凋亡。本研究进一步证实了DADS对人白血病K562细胞的生长抑制作用。MTT实验结果表明，DADS以剂量依赖方式抑制人白血病K562细胞的活性。许多研究表明，各种刺激，比如抗肿瘤药物、紫外线、离子辐射等都能刺激形成内源性的ROS，这种内源性的ROS在细胞的凋亡过程中起着非常重要的作用［13］。本研究中，用DADS处理人白血病细胞，细胞内ROS水平明显升高，呈时间依赖性方式。流式细胞术检测结果显示，5 mg·L－1DADS作用K562细胞后，ROS水平在1 h内迅速上升，8 h到达高峰，随后的4 h又开始下降。而且，用抗氧化剂NAC或JNK抑制剂sp600125预处理细胞后再用5 mg·L－1DADS作用细胞24 h，凋亡率分别明显下降(P＜0.05)。这些结果表明:DADS诱导人白血病细胞凋亡与ROS以及JNK有关。

大量研究已经表明，MAPK信号通路的成员，包括ERKs、JNKs和 p38 MAPK信号通路在细胞的生存和死亡上起着非常重要的作用［14］。有研究发现［15］，在DADS诱导人白血病细胞凋亡过程中，细胞活化的磷酸化ERKs的水平降低了，而活化的p38 MAPK的表达水平升高。JNK在许多肿瘤细胞凋亡上起着非常重要的作用，用遗传或者药理学途径抑制JNK的活性，可阻滞细胞的凋亡［16］。本研究结果表明，JNK特异性抑制剂 sp600125能明显降低DADS诱导人白血病细胞凋亡的能力，可见，JNK通路参与了DADS诱导人白血病细胞凋亡。众所周知，ROS是凋亡的启动者和调节者，但ROS本身不能直接激活caspase的级联反应，因此ROS诱导凋亡需要其他一些物质的参与，包括 JNK信号通路［17］。本研究实验结果表明，在DADS诱导人白血病K562细胞凋亡过程中有JNK1/2的活化。Western blot分析结果显示，5 mg·L－1DADS作用 K562细胞4 h后，与未处理组相比，磷酸化JNK1/2表达水平明显上调，8 h达到高峰，随后表达开始下降，这和检测到的ROS水平相一致。为了进一步研究JNK的活化与ROS的关系，我们在DADS诱导细胞凋亡中应用sp600125和NAC两种抑制剂来检测JNK的活化。在 DADS作用30 min之前用sp600125或 NAC预处理细胞，再用 5 mg·L－1DADS作用8 h后，磷酸化JNK表达水平(尤其是磷酸化JNK1)表达水平明显下降。这些结果表明:在DADS诱导人白血病K562细胞凋亡过程中有激酶JNK1/2的活化，激酶JNK1/2的活化是由ROS来调节的。当然，DADS诱导人白血病细胞K562凋亡的具体机制还有待于进一步研究。

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