全血MicroRNA-126—急性心肌梗死的新标记物

钱宗杰，谢福生

(桂林医学院附属医院心内科，广西 桂林 540011)

本刊网址:http://www.nsmc.edu.cn 作者投稿系统:http://noth.cbpt.cnki.net 邮箱:xuebao@nsmc.edu.cn

MicroRNAs(miRNAs，miRs)是新发现的一类非编码RNA 分子，它不编码蛋白质但能通过结合目的信使(mRNAs)的3'UTR 来调节基因的表达。miRNA 已被证实在细胞的增值、分化、凋亡过程中发挥重要作用［1－3］。

急性心肌梗死是一种伴随高死亡率的严重急性心血管疾病状态。急性心肌梗死及时、正确的诊断对灌注治疗挽救患者生命以及疾病的预后非常关键。目前AMI 的诊断主要依靠心电图改变以及生物标记物——肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I/T(cTnI/T)表达水平的升高。近年来针对MicroRNAs 在AMI 中作为新诊断依据的研究日益增多，肌源性miR-1、miR-133、miR-499 以及心肌特异性miR-208a 等都已经被证实在AMI 早期表达升高［4－5］。最新研究结果显示血浆miR-126 在急性心肌梗死早期表达升高，且升高趋势与cTnI 相一致［6］。

AMI 患者在AMI 早期全血中miR-126 表达水平是否与cTnI 表达水平趋势相一致?全血miR-126是否也能作为AMI 的早期诊断指标?本实验旨在验证这些问题。

1 材料和方法

1.1 入选标准

本研究遵守赫尔辛基宣言要求纳入病例，其中包括36 例AMI 患者及34 例对照组患者(均来自于我院心内科自2011 年1 月至2012 年8 月)。AMI诊断标准依据最新心肌梗死指南［7］:心肌标志物表达水平升高(cTnI 表达水平＞0.1 ng/mL 或者CKMB 表达水平升高一倍以上)并联合以下至少一项:胸痛持续时间大于20 min;心电图上出现病理性Q波;心电图提示心肌缺血(ST 段抬高或压低)以及新发生的存活心肌丢失或节段性室壁运动异常的影像学证据。入选的AMI 患者均在第一时间被诊断为心肌梗死且对照组患者均进行冠脉造影以排除冠状动脉心脏病(coronary heart disease，CHD)。排除标准为:心力衰竭(心衰)、心律失常、冠心病等心脏疾病病史，已知肾脏替代治疗，恶性肿瘤，几个月内的外科手术以及骨骼肌损伤史等任何可能影响肌源性MiRNAs 表达的因素。

1.2 标本采集与制备

在心肌梗死症状发作后的不同时间段:AMI 患者入院时(T0:4.85 h±1.5 h);AMI 发病8 h(T8:8 h±30 min);AMI 发病12 h(T12:12 h ±30 min);AMI 发病24 h(T24:24 h ±30 min);AMI 后第7 天收集全血标本(4 mL×2)。其中一份用于提取全血RNA，另一份血液标本离心机(SIGMA)离心10 min(1 000 r/min)，吸取上清，用于检测cTnI。血浆与全血标本均保存于－80 ℃冰箱(Thermo)中。

1.3 ELISA 法检测血浆cTnI 的表达

采用ELISA 法(Abnova，Taiwan)检测血浆中cTnI 的表达水平(详见说明书)。

1.4 RNA 分离及实时定量PCR(RT-PCR)

应用Trizol LS(Invitrogen，CA)提取全血样本中总RNA(详见说明书)。取1 μg 总RNA 根据M －MLV 逆转录酶说明书反转录合成cDNA(Promega，WI)，内参选用U6。逆转录引物序列如下:miR-126: 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCGAGG-3';U6:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。应 用 SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒(Biosystems，CA)，ABI7000实时定量PCR 仪(Biosystems，CA)进行逆转录(操作步骤详见说明书)。RT-PCR 反应引物序列如下:miR-126:上游引物序列5'-GGCTTCGTACCGTGAGTAAT-3'，下游引物序列5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3';U6:上游引物序列 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物序列 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。反应体系95 ℃孵育30 s 后开始循环程序:变性95 ℃，15 s;退火60 ℃，20 s;延伸70 ℃，60 s 共40 个循环。每个实验样本均设置复孔。实验数据使用ABI7000 System Software 分析，将Ct 值作为样本表达量标准，并用2－ΔΔCt计算方法计算miR-126 的相对表达水平。

1.5 统计学分析

应用SPSS13.0 软件分析实验数据，数据以均数(Mean)±标准差(SD)表示。计量数据采用方差齐性检验以及t 检验，计数数据采用卡方检验。绘制ROC 曲线评估全血miR-126 表达水平作为AMI 诊断指标的可靠性。统一将P ＜0.05 设定为有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基本资料的分析

对照组与AMI 组在年龄、性别、血压、血脂等方面均无统计学意义(P ＞0.05)，见表1。

表1 研究对象一般资料的比较

2.2 全血中miR-126 在AMI 患者以及对照组的表达水平

AMI 发生后不同时间点:T0(P ＜0.001)、T8(P =0.001)、T12(P =0.005)、T24(P =0.008)全血miR-126 表达水平较对照组明显升高且有统计学意义(P ＜0.05)。而在AMI 后第7 天时AMI 患者血浆中miR-126 表达水平与对照组无统计学差异(P ＞0.05)，见图1。

2.3 miR-126 与肌钙蛋白I 的关系

全血miR-126 在T0 时已经明显升高，T8 时达到峰值，随后逐渐下降并于第7 天降至正常水平。AMI血浆中cTnI 在T0 时表达水平明显升高且持续升高并于T24 时达到峰值，第7 天时恢复至正常水平。结果同时提示AMI 早期miR-126 与cTnI 的表达水平迅速升高且升高趋势一致，但全血中miR-126 表达水平较之cTnI 拥有更早的达峰时间，见图2。

2.4 全血miR-126 作为AMI 诊断指标的评估

全血miR-126 的AUC 值在T0:0.857(95%置信区间(CI)0.728 ～0.987，P ＜0.001);T8:0.86(95%CI:0.746 ～0.979，P ＜0.001);T12:0.827(95%CI:0.722 ～0.933，P ＜0.001);T24:0.789(95%CI:0.677 ～0.859，P =0.001)。结果提示全血中miR-126 在上述时间点作为AMI 的诊断指标时诊断价值均较高，见图3。

3 讨论

MiRNAs 通过对基因表达、蛋白质翻译以及靶RNA 的调控，参与了增殖、分化、迁移等多种生物学过程［8－10］。它在外周血中可以通过与蛋白质结合成蛋白——miRNA 复合体对RNA 酶产生抗性，从而在血清、血浆及其它体液中稳定存在，因而它们作为生物标记物在多种疾病的诊断中具有优势［11］。越来越多的研究［8，10］表明MiRNAs 在自身免疫疾病、炎症、肿瘤、心脏疾病等疾病的病理过程中发挥作用。

miR-126 是一种内皮细胞特异性MiRNA，它已经被证实参与了内皮细胞的增值、迁移、血管内皮的完整［12］。miR-126 在冠心病、糖尿病患者外周血中表达降低，却在心衰时表达升高［13－14］。但最新的研究［6］显示AMI 患者血浆miR-126 在心肌梗死早期表达升高。

我们的研究表明AMI 患者早期外周全血miR-126 明显升高，8 h 时达到峰值并于第7 天时降至正常范围。另外，AMI 患者在AMI 早期全血miR-126表达量较之cTnI 有更早的达峰时间，而且表达升高的时间窗也与cTnI 基本一致。这与AMI 血浆miR-126 表达升高的研究相一致。研究结果显示cTnI 与miR-126 有很好的相关性，并提示miR-126 较之cT-nI 更早升高可能因为其来源于心肌损伤时的损伤心肌进入血液循环。ROC 分析结果提示在AMI 早期miR-126 作为生物标记物准确诊断AMI 具有一定优势。上述表明miR-126 可能作为AMI 早期诊断的有效生物标记物，这不仅能够进一步提高AMI的确诊率，且能够更及时的发现AMI 从而更积极地挽救急性心肌梗死患者的生命。

日益增多的MicroRNAs 被证实不仅在心血管系统发育、血管生成等生理过程中发挥重要作用，而且参与了心肌梗死及心肌梗死后新生血管形成、心衰、心肌纤维化和心脏重塑等病理过程［15－16］。虽然MicroRNAs 在心血管疾病中作用的研究已经取得一定进展但其在心衰、心房纤颤、心肌梗死后心律失常等心血系统疾病中具体机制与作用的研究仅仅开始起步，仍需要大量的研究去证实。

［1］ Bartel DP，Chen CZ.Micromanagers of gene expression:the potentially widespread influence of metazoan microRNAs［J］.Nat Rev Genet，2004，5(5):396 －400

［2］ Bartel DP.MicroRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116(2):281 －297

［3］ Li C，Pei F，Zhu X，et al.Circulating microRNAs as novel and sensitive biomarkers of acute myocardial infarction［J］.Clin Biochem，2012，45(10 －11):727 －732

［4］ D'Alessandra Y，Devanna P，Limana F，et al.Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction［J］.Eur Heart J，2010，31(22):2765 －2773

［5］ Wang GK，Zhu JQ，Zhang JT，et al.Circulating microRNA:a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans［J］.Eur Heart J，2010，31(6):659 －666

［6］ Long G，Wang F，Duan Q，et al.Human circulating microRNA-1 and microRNA-126 as potential novel indicators for acute myocardial infarction［J］.Int J Biol Sci，2012，8(6):811 －818

［7］ Thygesen K，Alpert JS，White HD.Universal definition of myocardial infarction［J］.J Am Coll Cardiol，2007，50(22):2173 －2195

［8］ Kloosterman WP，Plasterk RH.The diverse functions of microRNAs in animal development and disease［J］.Dev Cell，2006，11(4):441 －450

［9］ Wu W.MicroRNA:potential targets for the development of novel drugs［J］.Drugs RD，2010，10(1):1 －8

［10］ Lu M，Zhang Q，Deng M，et al.An analysis of human microRNA and disease associations［J］.PLoS One，2008，3(10):e3420

［11］Turchinovich A，Weiz L，Langheinz A，et al.Characterization of extracellular circulating microRNA［J］.Nucleic Acids Res，2011，39(16):7223 －7233

［12］ Wang S，Aurora AB，Johnson BA，et al.The endothelial-specific microRNA miR-126 governs vascular integrity and angiogenesis［J］.Dev Cell，2008，15(2):261 －271

［13］ Fukushima Y，Nakanishi M，Nonogi H，et al.Assessment of plasma miRNAs in congestive heart failure［J］.Circ J，2011，75(2):336 －340

［14］ Zampetaki A，Kiechl S，Drozdov I，et al.Plasma microRNA profiling reveals loss of endothelial miR-126 and other microRNAs in type 2 diabetes［J］.Circ Res，2010，107(6):810 －817

［15］ Fichtlscherer S，Zeiher AM，Dimmeler S.Circulating microRNAs:biomarkers or mediators of cardiovascular diseases［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011，31(11):2383 －2390

［16］Xu J，Zhao J，Evan G，et al.Circulating microRNAs:novel biomarkers for cardiovascular diseases［J］.J Mol Med (Berl)，2012，90(8):865 －875