rhFSH对雄激素致不孕大鼠局灶性脑缺血大脑皮质AKT及PDGF－B基因表达的影响

周家文，陆玉熊，李洪岩，项喜艳，张 勇，孙连坤，康劲松＊

（1.吉林大学中日联谊医院 妇产科，吉林 长春130033；2.吉林大学白求恩医学院病理生理学教研室，吉林 长春130021）

大量的临床研究资料表明由于性别的不同，中风的发生率及结局明显不同［1］。女性在绝经前中风发病率较同年龄段男性低，但绝经后发病率明显上升。临床回顾性研究发现绝经后的女性接受雌激素或雌激素加孕酮治疗者，中风发病率和病死率均下降，说明性激素在中枢神经系统损伤中起一定作用［2，3］。本实验所采用的大鼠均为雄激素致不孕大鼠（ASR），是一种由高雄激素引起的无排卵的动物模型［4］。这种动物模型除可作为不孕大鼠模型外，还可以用于观察体内性激素紊乱对机体的影响。重组人促卵泡激素（rhFSH）具有促进雌激素分泌的作用，研究表明，FSH的新功能已被确认超出繁殖调控，在中枢神经系统损伤调控中起一定作用。果纳芬是临床上常用一种FSH。本实验的目的是在成功建立ASR模型的基础上给予rhFSH治疗后，线栓法制作大鼠大脑中动脉（MCAO）模型，用以探讨果纳芬（rhFSH）对缺血大脑皮层AKT及PDGF－B基因表达的影响及脑保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；RT－PCR试剂购自日本Takara公司；PCR引物合成由中国联星公司完成；琼脂糖和M－MuLV反转录酶购自美国Promega公司；DEPC（焦磷酸二乙酯）购自美国Sigma公司；重组人促卵泡激素（果纳芬）（批号：Y02A7773）由雪兰诺公司瑞士药厂购买。PCR扩增仪购自日本Takara公司；凝胶成像分析系统购自中国上海天能科技有限公司；RNA定量仪来自德国Eppendorf；电 泳 仪 和－80℃ 低 温 冰 箱 由 日 本SANYO公司生产；高速低温离心机由日本久宝田生产。

1.2 雄激素致不孕大鼠（ASR）模型的制备

健康9日龄Wistar雌性幼鼠，购于吉林大学实验动物中心，体重（20±2）g。参照本室方法［4］：采用9日龄的雌性大鼠颈背部皮下一次性注射丙酸睾酮1.25mg·只－1（0.05ml·只－1），复制雄激素致不孕大鼠模型。第70天起进行连续阴道上皮细胞涂片11d，阴道上皮细胞持续角化无动情周期出现者，提示无排卵大鼠模型制作成功。

1.3 动物分组及给药方法

将复制成功的成年Wistar雌性不孕大鼠（ASR）随机分为 ASR＋sham组、ASR＋MCAO组、ASR＋rhFSH＋sham组及 ASR＋rhFSH ＋MCAO组。前2组每日肌内注射生理盐水（200μl／只），后2组每日肌内注射16IU·200μl－1·只－1rhFSH，连续12d。在肌注的第11天，进行大脑中动脉阻塞模型的制备。

1.4 大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型的制备

利用本室常规方法成功制备大鼠MCAO模型［5］，24h后断头处死各组动物，迅速分离大脑皮质，液氮冻存备用。

1.5 基因表达检测

大脑皮质总RNA的提取参照Trizol试剂盒的方法提取总RNA。经逆转录合成cDNA，分别使用GAPDH，AKT，PDGF－B的引物进行PCR反应。GAPDH 引 物：Sense：5’－GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT－3’，Antisense：5’–AAGAATGGGTGTTGCTGTTGAAGTC－3＇，PCR 循 环 条 件为：94℃，30s，退火58℃，30s，延伸72℃，60s，28个循环，扩增目的片段为617bp。AKT引物：Sense：5’－TCTACGGTGCGGAGATTGTG－3’，Anti－sense：5′－TCCCGG－TACACCACGTTC TT－3′，PCR循环条件为变性94℃，30s，退火57℃，45 s，延伸72℃，45s，30个循环，PCR产物为78bp。PDGF－B 引 物：Sense：5′－GAAGCCAGTCTTCAAG AAGGCCAC －3′，Anti－sense：5′－AACGGTCACCCGAGTTTGAGGTGT－3′PCR 循环条件为变性94℃，30s，退火57℃，45s，延伸72℃，45s，30个循环，PCR产物为171bp。30个循环后取PCR产物进行琼脂糖2%凝胶电泳，凝胶成像系统分析目的条带光密度值，以目的基因与内参GAPDH比值确定其含量。

1.6 统计方法

2 结果

2.1 行为学评分

在大脑中动脉阻塞后，分别在大鼠清醒时（0h）及24h进行神经行为学评分。ASR＋sham组与ASR＋rhFSH＋sham组均为假手术组，大鼠行为无异常，得分为0。ASR＋MCAO组大鼠清醒后即出现明显的神经运动功能障碍体征，右侧肢体肌力下降，提尾时右前肢内收屈曲，爬行时偏向右侧打圈，甚至向右侧倾倒，其平均得分为3.10±0.43；ASR＋rhFSH＋MCAO组大鼠神经运动功能障碍体征明显减轻，其平均得分为2.30±0.32，与ASR＋MCAO组相比具有统计学意义（P＜0.05）。24h时测定神经行为评分，无论ASR＋MCAO组还是ASR＋rhFSH＋MCAO组大鼠的神经运动功能均得到一定的改善，但ASR＋rhFSH ＋MCAO组神经行为评分明显低于ASR＋MCAO组（P＜0.05）（见表1）。

表1 rhFSH对雄激素致不孕大鼠（ASR）局灶性脑缺血神经行为评分的影响

2.2 rhFSH对雄激素致不孕大鼠局灶性脑缺血大脑皮质AKT的影响

RT－PCR电泳结果表明，与ASR＋sham组比较，ASR＋rhFSH＋sham组的AKT mRNA表达水平未见明显改变（P＞0.05）；与ASR＋sham组比较，ASR＋MCAO组大鼠大脑皮质缺血侧AKT mRNA的表达明显降低（P＜0.05）。与 ASR＋rhFSH＋sham组比较，ASR＋rhFSH＋MCAO组大鼠缺血侧大脑皮质AKT mRNA的表达均未见明显改变（P＞0.05）（见图1）。

2.3 rhFSH对雄激素致不孕大鼠局灶性脑缺血大脑皮质PDGF B的影响

RT－PCR电泳结果表明，与ASR＋sham组比较，ASR＋rhFSH＋sham组的PDGF B mRNA表达水平未见明显改变（P＞0.05）；与ASR＋sham组比较，ASR＋MCAO组大鼠大脑皮质缺血侧PDGF mRNA的表达明显增高（P＜0.05）。与 ASR＋rhFSH＋sham组比较，ASR＋rhFSH＋MCAO组大鼠缺血侧大脑皮质PDGF B mRNA的表达亦明显增高（P＜0.05）（见图2）。

图1 rhFSH对雄激素致不孕大鼠局灶性脑缺血大脑皮质中AKTmRNA表达的影响

图2 rhFSH对雄激素致不孕大鼠局灶性脑缺血大脑皮质中PDGF B mRNA表达的影响

3 讨论

研究表明，体内性激素的变化在脑损伤过程中起一定作用［6］，但性激素对 AKT和PEGF－B在脑损伤的影响未见报道。本研究在雄激素致不孕大鼠（androg en－induced sterile rats，ASR）的基础上，给予重组人促卵泡激素（recombinant human follitropin，rhFSH）治疗后，通过线栓法又制备了大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，用以探讨体内性激素的变化对局灶性脑缺血AKT及PEGF－B的影响。

Akt又名蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，在神经生长因子依赖的细胞存活信号途径中具有重要作用，缺血的短时间内增加其活性可起到保护神经元损伤作用，而其活性的下降是脑缺血神经细胞损伤的主要原因。大量的研究表明，Akt表达量增加可显著减少缺血损伤的面积、抑制细胞凋亡［7］。本实验的结果证明局灶性脑缺血组缺血侧大脑皮质中Akt的mRNA水平明显降低，是脑缺血神经细胞损伤的一个主要原因，在给与rhFSH治疗后，Akt的mRNA水平明显增加，提示雌激素通过上调Akt的表达，激活PI3－K／Akt通路，从而减轻脑损伤。

血小板衍生生长因子（PDGF）是一种具有广泛生物学作用的多肽，它是体内较强的促有丝分裂剂和化学诱导剂，与机体组织的生长、发育以及各种损伤后修复有密切的关系。研究表明，PDGF在脑损伤修复及促进血管重塑中具有重要作用。外源性PDGF－B可以预防大鼠脑缺血后的迟发性神经元死亡，产生神经保护效应［8］。PDGF－Rβ在卒中后血管重塑过程中是一个关键因子，PDGF－B的营养功能可以通过受体的表达来进行调节［9，10］。卒中后，PDGF－B／PDGF－Rβ系统通过介导内皮细胞与周细胞的的相互作用来支持血管再生以及重塑，参与神经保护作用。新生血管的生长可能由于能够增加对缺血组织营养和氧气的运送，从而增加缺血缺氧的耐受性，减轻缺血缺氧的损伤。本实验中在给与rhFSH治疗后，PDGFB的mRNA水平明显增加，提示雌激素可加速血管的生成，进一步促进脑损伤的修复。

综上所述，rhFSH可能通过对AKT及PDGF的调节，促进血管增生以及重塑，导致细胞存活增多，从而减轻脑损伤。

［1］Stegmayr，B，Asplund K，Kuulasmaa K，et al.Stroke incidence and mortality correlated to stroke risk factors in the WHO MONICA Project：an ecological study of 18populations［J］.Stroke，1997，28：1367.

［2］Paganini－Hill A，Ross RK，and Henderson BE.Postmenopausal oestrogen treatment and stroke：aprospective study［J］.BMJ，1988，297（6647）：519.

［3］Scott E，Zhang QG，Wang R，et al.Estrogen neuroprotection and the critical period hypothesis［J］.Front Neuroendocrinol，2012，33（1）：85.

［4］周家文，张 勇，王 皓，等.重组人促卵泡激素对雄激素致不孕大鼠局灶性脑缺血脑皮质RAS相关基因表达的影响［J］.吉林大学学报（医学版），2009，35（2）：238.

［5］周家文，孙际童，王 岩，等.大鼠局灶性脑缺血脑皮质线粒体氯通道基因的表达［J］.中国老年学杂志，2008，28（16）：1561.

［6］Petitti DB，Sideny S，Bernstein A，et al.Stroke in users of lowdose oral contraceptives［J］.N Engl J Med，1996，335（1）：8.

［7］Ohba N，Kiryu－Seo S，Maeda M，et al.Transgenic mouse overexpressing the Akt reduced the volume of infarct area after middle cerebral artery occlusion［J］.Neurosci Lett，2004，359（3）：159.

［8］Iihara K，Hashimoto N，Tskahara T，et al.Platelet－derived growth factor BB，but not AA，prevents delayed neuronal death agter forebrain ischemia in rats［J］.J CereB Blood Flow，1997，17：1097.

［9］Morioka I，Tsuneishi S，Takada S，et al.PDGF－alpha receptor expression following hypoxic－ischemic injury in the neonatal rat brain［J］.Kobe J Med Sci，2004，50（1－2）：21.

［10］Shen J，Ishii Y，Xu G，et al.PDGFR－βas a positive regulator of tissue repair in a mouse model of focal cerebral ischemia［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2012，32（2）：353.