不同破壁方法提取结核分枝杆菌总RNA的比较

罗影殊 高文凤 黄偌颖 刘衡川

不同破壁方法提取结核分枝杆菌总RNA的比较

罗影殊 高文凤 黄偌颖 刘衡川

目的建立简便有效的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）总RNA提取方法>。方法采用5种方法，分别为160、240和400W超声波联合Trizol法（简称“160W超声法”、“240W超声法”和“400W超声法”）、玻璃珠（简称“玻珠”）联合Trizol法（简称“玻珠法”）和Trizol法（简称“不加玻珠法”），对结核分枝杆菌标准株H37Rv进行破壁，提取总RNA。通过荧光定量逆转录PCR评价不同破壁方法对Mtb总RNA提取效果的影响，以灭菌超纯水代替模板为阴性对照。每种方法分别提取3份样本进行检测。最后结果为3份标本的平均值>。结果玻珠法检测组Ct值为20.67，△Rn值为0.644；400W 超声法检测组Ct值为22.09，△Rn值为0.571；240W超声法检测组Ct值为21.86，△Rn值为0.503；160W超声法检测组Ct值为25.21，△Rn值为0.411；不加玻珠法检测组Ct值为28.40，△Rn值为0.299；阴性对照Ct值为40.00，△Rn值为0.000>。结论直观地从试验结果来看，玻珠法对结核分枝杆菌破壁效果好于超声法。

分枝杆菌，结核； RNA，细菌； 逆转录聚合酶链反应； 细胞壁； 细菌学技术

20世纪80年代以来，结核病再次在全球肆虐，成为严重威胁人类健康的公共卫生问题。我国的结核病疫情形势十分严峻，每年新登记的结核病患者约130万，因结核病死亡者每年达13万例。回顾性调查结果显示我国结核病的误诊率可达24.1%［1］，提高实验室检测能力，促进早诊断、早治疗是有效控制结核病蔓延的必要措施。目前，我国通过抗酸染色和细菌培养等方法发现肺结核患者并监测疗效。传统检测方法不利于快速准确地诊断肺结核以及疗效的评价，急需开发快速准确的检测方法。

随着基因组学和蛋白质组学的发展，相关技术也逐渐应用于结核快速诊断，如免疫学方法、PCR、核酸杂交等。PCR尤其是荧光定量PCR已作为结核病诊断的辅助实验，其中对DNA的研究颇多［2－3］。但DNA较稳定，检测存在平台效应。研究表明，在抗酸染色和痰培养转阴后仍能检测到痰液中的DNA［4－5］。因此，DNA 不能用于结核分枝杆菌的活菌检测。原核生物的mRNA不稳定，易降解，半衰期仅为数分钟。因此，mRNA可作为活菌检测的标志物。国内外已有基于mRNA的RT-PCR检测活菌的成功报道［6－8］。

总RNA的提取是mRNA检测最为关键的步骤，所得RNA的纯度和完整性对实验结果有较大的影响。结核分枝杆菌细胞壁特殊，难以像其他细菌通过去污剂或裂解剂裂解，需在常规RNA提取方法的基础上辅以超声波或加玻璃珠（简称“玻珠”）等机械破碎手段。

本课题在异硫氰酸胍－酚－氯仿抽提法（Trizol法）的基础上，比较玻珠和不同功率的超声波对结核分枝杆菌的破壁效果，以建立高效的结核分枝杆菌总RNA提取方法。

材料和方法

一、材料

1.实验菌株：结核分枝杆菌标准株H37Rv，来自成都市结核病防治研究院。

2.主要试剂和仪器：直径0.5mm玻珠（美国Sigma公司）；RNAiso Plus、Taq聚合酶［宝生物工程（大连）有限公司］；PrimeScript®RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒［宝生物工程（大连）有限公司］；中性罗氏培养基（博慧斯生物医药科技有限公司）；超声仪（成都肯格王三氧电器设备有限公司）和荧光定量PCR仪（上海宏石医疗科技有限公司）。

3.引 物 序 列：上 游 引 物：5′-GACAGACGTGAGCCGAAAGAT-3′；下 游 引 物：5′-GGAAGGACTACAGCCGCTG-3′；分子信标探针：5′-FAMCTTGGGGACGCCGATTGATGATCCAAGDABCYL-3′。由宝生物工程（大连）有限公司合成。

二、方法

（一）细菌培养

用灭菌的接种环轻轻刮取H37Rv菌落，接种于改良罗氏培养基，37℃培养20～25d。

（二）结核分枝杆菌总RNA提取方法

取5支1.5ml eppendorf（EP）管，各称取0.2g H37Rv菌体，分别标记为160W超声法组、240W超声法组、400W超声法组、玻珠法组和不加玻珠法组。各组分别加入1ml Trizol试剂，漩涡振荡混匀。处理如下：160W超声法组、240W超声法组和400W超声法组－70℃ 放置10min，沸水速融，分别经过160W、240W和400W超声波处理3次，每次3min，间歇10s。玻珠法组加玻珠（0.2g）；不加玻珠法组不做处理；玻珠法和不加玻珠法组漩涡振荡器振荡1min。5个实验组分别加入200μl氯仿，振荡30s，室温放置10min。4℃，12 000×g离心15min，样品分为3层，上层（无色水相）、中间层和粉红色有机层；取500μl上层无色水相于新的EP管中，加入300μl糖原（1000μmol／ml）和500μl异丙醇，室温10min。4℃，10 000×g离心10min；弃上清，加600μl 75%乙醇，摇匀。4℃，7000×g离心5min。弃去上清，室温尽量干燥，加入30μl DEPC（diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）水溶解沉淀，保存于－70℃冰箱。如样本为痰液，则需先进行液化再提取RNA。具体步骤为：加2～4倍痰液体积的4%NaOH，漩涡振荡器混匀，室温放置20min，12 000×g离心10min，弃上清。加500ml无菌水，漩涡振荡器混匀，12 000×g离心5min，弃上清。重复上次操作。5种方法分别提取3份样本的总RNA。

（三）RNA逆转录生成cDNA

1.总RNA基因组中残留DNA的去除：为防止总RNA提取液中DNA造成结果假阳性，通过gDNA Eraser去除上述5种方法提取的总RNA标本中的DNA。体系为5×gDNA Eraser Buffer 2μl，gDNA Eraser 1μl，灭菌超纯水2μl，总RNA模板5μl，总体积10μl。42℃孵育2min（PCR仪中进行）。产物－70℃保存。

2.RNA逆转录：将上述去除DNA的RNA提取液作为模板，进行逆转录过程（表1）。体系为去除DNA的RNA10μl，灭菌超纯水4μl，5×Prime-Script®Buffer 4μl，Reverse Transcription Primer Mix（逆转录引物混合物）1μl，PrimeScript®RT Enzyme Mix 1μl，总体积20μl。37℃孵育15min，85℃5s（PCR仪中进行）。产物可用于荧光定量PCR检测，－20℃保存。

3.总RNA中混有基因组DNA的去除效果的测定：上述5种方法提取的总RNA均按表1进行实验分组，验证DNA去除效果。阴性对照以灭菌超纯水代替模板。

表1 RNA提取液中DNA去除效果验证试验

4.荧光定量 PCR 检测［9］cDNA：RNA 提取液中DNA去除效果验证试验、模拟痰样本的荧光定量PCR检测步骤均按以下操作进行。分子信标荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的反应的体系：灭菌超纯水 8.65μl，10×Buffer 2.5μl，MgCl26μl，dNTP 1μl，上下游引物各0.5μl，分子信标探针0.25μl，Taq DNA聚合酶0.6μl，模板5μl，总体积为25μl。阴性对照以灭菌超纯水代替模板。

反应循环条件为：94℃3min，94℃20s，61℃20s，72℃20s，40个循环。反应结束后，以荧光定量PCR分析软件设定基线和阈值（0.05），得到以循环数（Ct值）为横坐标、荧光值（△Rn值）为纵坐标的定量扩增曲线。Ct值≤38为阳性，＞38为阴性。

5.模拟痰样的制作及检测：称取0.2g新鲜培养的结核分枝杆菌H37Rv菌体2份，一份加入一定量的正常人痰液中，另一份不做处理。两份样本均按玻珠法提取RNA，gDNA Eraser去除DNA，逆转录得到cDNA，通过荧光定量PCR检测，评价所用总RNA提取方法对模拟痰液中结核分枝杆菌的提取效率。阳性对照为水煮得到的结核分枝杆菌H37Rv DNA，阴性对照以灭菌超纯水代替模板。

结 果

一、总RNA中混有基因组DNA的去除效果

图1为玻珠法组实验结果。设定阈值为0.05，可见逆转录产物组有明显跃迁，去DNA产物组无跃迁，说明gDNA Eraser可去除RNA提取物中的DNA，且不会影响RNA的检出。其余4种方法结果与玻珠法组相同。因此，gDNA Eraser是有效的基因组去除剂。

图1 玻珠组荧光定量逆转录PCR检测gDNA Eraser去除DNA效果的扩增曲线图

二、5种RNA提取方法提取效率的比较

设定阈值为0.05，玻珠法检测组Ct值为20.67（20.83、20.12、21.06），△Rn 值为 0.644（0.653、0.612、0.667）；400W 超声法检测组 Ct值为22.09（22.23、21.85、22.19），△Rn 值为 0.571（0.573、0.557、0.584）；240W 超声法检测组 Ct值为21.86（21.78、21.26、22.54），△Rn 值为 0.503（0.500、0.516、0.493）；160W 超声法检测组 Ct值为25.21（25.34、25.40、24.89），△Rn 值为 0.411（0.403、0.400、0.431）；不加玻珠法检测组 Ct值为28.40（28.22、28.02、28.96），△Rn 值为 0.299（0.299、0.313、0.284）；阴性对照Ct值为40.00，△Rn值为0.000。玻珠法检测组Ct值最小，表明在5种RNA提取方法中，加玻珠破壁提取结核分枝杆菌总RNA效果最好。图2为其中的1次结果。

图2 5种结核分枝杆菌RNA提取方法提取效率的扩增图谱

三、模拟痰样检测结果

通过荧光定量逆转录PCR检测玻珠法提取的模拟痰样组和未处理组结核分枝杆菌总RNA，结果如图3所示。模拟痰样组Ct值（28.93）略大于未加痰液组（25.57），说明玻珠法能有效提取模拟痰样中的结核分枝杆菌总RNA。

图3 荧光定量逆转录PCR检测模拟痰样扩增曲线图

讨 论

对于特殊生物样本，如组织、革兰阳性菌和真菌等，单独使用异硫氰酸胍－酚－氯仿法并不能有效裂解细胞，导致RNA提取效率降低。因此，提取组织、革兰阳性菌和真菌等生物样本的RNA时，需在化学裂解细胞的基础上辅助其他手段。如提取组织RNA常在Trizol（总RNA抽提试剂）前加入液氮中机械研磨，使组织充分分散破碎［10］。革兰阳性菌多采用加入溶菌酶使细胞壁水解［11］。真菌RNA的提取可在Trizol的基础上辅助碾磨、超声波或玻珠等机械破碎方法［12－13］。

结核分枝杆菌细胞壁特殊，坚韧性较强，含有大量分枝菌酸、阿拉伯半乳糖成分，多糖和磷脂含量丰富。单纯使用Trizol法提取结核分枝杆菌RNA较困难。由于结核分枝杆菌可通过空气传播，不适用液氮研磨；细胞壁中脂质含量高，对溶菌酶有一定的抗性。已报道的结核分枝杆菌总RNA提取方法中，Gill等［14］报道加入玻珠可提高提取效率；刘根焰［15］研究发现，超声波能破碎结核分枝杆菌细胞壁，可得到用于PCR检测的较高纯度和质量的总RNA。因此，本实验通过比较玻珠和不同功率超声波联合Trizol法，对结核分枝杆菌总RNA的提取方法进行优化。

通过荧光定量RT-PCR Ct值比较各实验组RNA提取效率。结果显示，超声波组RNA Ct值小于Trizol组，说明超声波有助于结核分枝杆菌细胞壁的破裂。不同功率试验结果表明，随着功率的增大，结核分枝杆菌RNA提取效率有一定程度的提高；但240W和400W组荧光定量RT-PCR Ct值接近，提示当功率增大到一定程度，超声波对细菌的破碎效果可能达到平台期。玻珠组RNA Ct值小于超声波组，可能是玻珠振荡对结核分枝杆菌细胞壁的破碎作用大于超声波；也可能是超声波在破碎细菌的同时会对RNA造成一定程度的断裂。另外，玻珠法不需要特殊仪器，优于超声波法，更利于推广。模拟痰样检测结果也表明，玻珠法可有效提取痰液中结核分枝杆菌总RNA。

综上所述，玻珠联合Trizol法能够快速、高效地提取结核分枝杆菌总RNA，有利于建立基于mRNA的荧光定量RT-PCR快速检测活结核分枝杆菌。

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The comparison of different wall-breaking method for extracting total RNA ofMycobacterium tuberculosis

LUO Ying-shu＊，GAO Wen-feng，HUANG Ruo-ying，LIU Heng-chuan.＊Department ofMedical Technology，West China School ofPublic Health，Sichuan University，Chengdu 610041，China

：LIU Heng-chuan，Email：lhc54＠sohu.com

ObjectiveTo establish a simple and effective total RNA extraction method ofMycobacterium tuberculosis. Methods Cell wall ofMycobacterium tuberculosiswere treated by ultrasonic and glass-bead associated with Trizol method respectively，the total RNA was extracted and the influence of different total RNA extraction methods of Mtb were evaluated through fluorescent quantitative RT-PCR.The negative control is ultrapure water instead of template.Each method were extracted from 3samples for testing.The final result is the average of 3specimen. Results The Ct and△Rn value of glass-bead group is 20.67and 0.644，400Wultrasonic group is 22.09and 0.571，240Wultrasonic group is 21.86and 0.503，160Wultrasonic group is 25.21and 0.411，bead absent group is 28.40and 0.299，negative control is 40.00and 0.000. Conclusion The wall-breaking effection of glass-bead method is better than that of ultrasonic method.

Mycobacterium tuberculosis； RNA，bacterial； Reverse transcriptase polymerase chain reaction；Cell wall； Bacteriological techniques

610041成都，四川大学华西公共卫生学院医学检验教研室（罗影殊、黄偌颖、刘衡川）；四川省疾病预防控制中心结核病预防控制所（高文凤）

刘衡川，Email：lhc54＠sohu.com

2012-10-31）

（本文编辑：张晓进）