宣肺止嗽汤对感染后咳嗽大鼠肺泡灌洗液中细胞因子的影响

王 文,李飞侠,朱 佳

(1.南京中医药大学,南京 210046;2.江苏省中医院,南京 210029)

感染后咳嗽(Post infectious cough,PIC)作为一种独立性疾病,近年来因发病率较高而逐渐被医学界认识并提出。由于目前对感染后咳嗽发病机理尚不确定,治疗上仍没有针对性和切实有效的方法”近年来许多医家对感染后咳嗽的临床治疗进行了诸多探索及研究,但对中药治疗感染后咳嗽机理仍属于摸索阶段,治疗效果尚不能令人满意。有研究证实[1],细胞因子IL-4、IL-5、IL-8、TNF-a等均与气道炎症与气道高反应性有密切联系。本实验即探讨上述细胞因子在咳嗽感染后咳嗽发生中的作用以及中药对上述细胞因子影响,从而揭示宣肺止嗽汤作用于感染后咳嗽的可能机制。

1 实验材料

1.1 动物 健康雄性纯白SD大鼠60只,SPF级,体质量180～220 g,由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供,并由江苏省中医药研究院动物饲养室(清洁Ⅱ级)饲养。

1.2 药物 宣肺止嗽汤主要组成炙麻黄、牛蒡子、杏仁、紫菀、蝉蜕等,按处方配伍用量配制,购自安徽亳州市华龙中药饮片厂,浸水 2 h,煮沸再用文火煎40 min,过滤后药渣再次加水文火煎,重复3次,合并煎煮液,经水浴浓缩,使终浓度相当于每1 mL含生药3.25 g,本汤剂由江苏省中医药研究院煎药室煎制;置于4℃冰箱中备用。经人与动物剂量换算标准确定大鼠灌胃剂量。惠菲宁由美国惠氏制药公司生产(国药准字H20030054)。

1.3 试剂 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、辣椒素(capsaicin,Cap)均购自美国Sigma公司;RD Rat Interleukin 4(IL-4)Elisa测定试剂盒,RD Rat Interleukin 5(IL-5)Elisa测定试剂盒,RD Rat Interleukin 8(IL-8)Elisa测定试剂盒,RD Rat Tumor Necrosis Factor a(TNF-α)Elisa测定试剂盒均由南京建成生物科技公司提供(进口分装)。

1.4 仪器 Devilbiss 646型雾化器,购自美国Devilbiss公司,输出流量为0.037 mL/min,输出口与双室透明塑料盒的头室相连接;PG503-S电子天平,梅特勒公司;Lab systems Finn pipette 100μL单道移液器;Thermo 50μL 8道移液器;HH-4数显恒温水浴锅(国华电器有限公司),华东电子DG5033A酶标仪(南京华东电子集团医疗装备有限责任公司)。

2 实验方法

2.1 感染后咳嗽模型的建立 将50只大鼠置于特制的1 m3的烟室中,以锯屑末50 g加10支南京牌香烟点燃烟熏,每日熏烟40 min,连续12 d,自由进食,饮水,每天观察记录其症状体征变化;第 13、16、19天,用 10%水合氯醛浅麻醉所有大鼠,鼻腔滴入0.4 mg/mL浓度的 LPS 溶液 10 μL/10 g,第 14、15、17、18、20天将大鼠置于透明密闭容器中雾化吸入10-4mol/L的辣椒素溶液3 min,观察 2min。

2.2 动物分组及给药治疗 模型复制成功后,于实验的第21天,将50只大鼠随机分成5组,每组10只。其中A组为模型组,灌服生理盐水1 mL/100 g,1次/d;B组为宣肺止嗽汤低剂量组,灌服宣肺止嗽汤(低剂量),生药4.71 g/kg,1次/d(相当于成人剂量的5倍);C组为宣肺止嗽汤中剂量组,灌服宣肺止嗽汤(中剂量),生药9.42 g/kg,1次/d(相当于成人剂量的10倍);D组为宣肺止嗽汤高剂量组:灌服宣肺止嗽汤(中剂量),生药14.13 g/kg,1次/d(相当于成人剂量的15倍);E组为阳性对照惠菲宁组:灌服惠菲宁3倍稀释液 8 mL/kg,1次/d(相当于成人剂量的10倍)。治疗2周后处死动物收集标本,所有大鼠均于末次给药的当天晚上禁食,第2天上午处死。

2.3 标本留取及处理 在灌胃治疗2周后,采用脱颈椎法处死大鼠,剪开胸腔,分离出完整的气管、支气管和肺组织,结扎右侧主支气管,用接注射器的灌洗器通过左侧支气管向左侧肺叶注入0.9%生理盐水2 mL,进行支气管肺泡灌洗液(BALF)收集:缓慢注入4℃含生理盐水2 mL行支气管肺泡灌洗,缓慢抽吸3次,保留30 s后缓慢回吸,重复3次。所得灌洗液经低温离心(3 000 r/min,4℃,10 min),保留上清液,于-80℃保存以待测。取冻干上清液采用ELISA法测定各组大鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-8、TNF-α水平 (具体测定方法严格按照试剂盒说明书进行操作)。

2.4 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件进行分析,全部数据均表示为均数±标准差±s),组间比较用t检验。

3 实验结果

从表1、2可以看出,正常组 BALF中 IL-4、IL-5、IL-8、TNF-α较低 ,而模型组 BALF 中 IL-4、IL-5、IL-8、TNF-a明显增加。宣肺止嗽汤低、中、高剂量组及模型组比较其 IL-4、IL-5、IL-8、TNF-a水平均明显降低(P<0.01),与空白组比较水平相当(P>0.05),说明宣肺止嗽汤及惠菲宁均可抑制炎症介质的释放,且两者作用相似,其中宣肺止嗽汤的治疗效果与药物剂量无特殊关联。

表1 各组大鼠 BALFIL-4、IL-5、IL-8、TNF-α吸光度(OD值)比较±s,n=10)

表1 各组大鼠 BALFIL-4、IL-5、IL-8、TNF-α吸光度(OD值)比较±s,n=10)

注:与空白组比较,△P<0.05;模型组比较,■P<0.05。

组 别 IL-4吸光度 IL-5吸光度 IL-8吸光度 TNF-α吸光度空白组 1.105±0.056 0.793±0.015■ 0.859±0.017 0.889±0.017模型组 1.259±0.039△ 0.948±0.028△ 1.092±0.030△ 1.080±0.049△宣肺止嗽汤低剂组 1.127±0.036■ 0.741±0.020■ 0.828±0.021■ 0.900±0.041■宣肺止嗽汤中剂组 1.082±0.054■ 0.706±0.036■ 0.795±0.027■ 0.812±0.041■宣肺止嗽汤高剂组 1.111±0.050■ 0.805±0.012■ 0.905±0.020■ 0.890±0.009■惠菲宁 1.150±0.058■ 0.801±0.014■ 0.900±0.015■ 0.897±0.045■

表2 各组大鼠BALFIL-4、IL-5、IL-8、TNF-α含量值比较±s,n=10)

表2 各组大鼠BALFIL-4、IL-5、IL-8、TNF-α含量值比较±s,n=10)

注:与空白组比较与,△P<0.05;与模型组比较,■P<0.01。

组 别 NIL-4含量/(pg/L) IL-5含量/(ng/L) IL-8含量/(ng/L) TNF-α含量/(ng/L)空白组 139.94±15.23 108.68±3.01 143.81±3.87 189.34±4.71模型组 196.09±14.35△ 145.32±7.37△ 204.53±8.58△ 245.21±17.58△宣肺止嗽汤低剂组 144.88±10.58■ 97.99±4.02■ 136.50±4.81■ 188.81±12.10■宣肺止嗽汤中剂组 133.80±13.67■ 91.60±7.03■ 129.05±6.31■ 166.37±11.45■宣肺止嗽汤高剂组 141.57±12.96■ 111.08±2.54■ 154.75±4.92■ 189.21±2.24■惠菲宁 149.82±12.79■ 110.44±2.67■ 153.44±3.53■ 193.60±16.12■

4 讨论

目前认为气道炎症是气道高反应性的基础,而细胞因子IL-4为THz细胞所释放的主要细胞因子,在Th细胞分化过程中,IL-4能调控单核细胞释放细胞因子,促进THz的发育分化,诱导THz细胞因子产生,启动和维持炎症反应,促进IgE的合成与分泌,并增加炎性细胞的浸润和活化[2]。IL-5是一种作用于Eos的血源性生长因子,可激活并趋化EOS,上调其黏附分子如CDllb的表达,促进Eos同内皮细胞黏附[2]。同时IL-4,IL-5均能刺激肥大细胞增殖,抑制Thl分泌IFN-γ其分泌异常导致IgE过量产生,引起气道炎症,诱发AHR。IL-8是趋化性细胞因子超家族的一员,可趋化和激活中性粒细胞、T淋巴细胞,促进其脱颗粒,产生多种炎性介质,TNF-α这种由巨噬细胞分泌的肽类炎性介质,是气道强而有力的刺激剂,对中性粒细胞亦有很强的激活作用,可诱导一系列细胞因子的产生,使气道产生炎性改变,气道反应性增高[4-5]。这些都表明细胞因子白介素-5、4、8及α-肿瘤坏死因子(TNF-α)与气道炎症的形成关系及气道高反应关系密切。

本研究结果表明,从表1、2可以看出,正常组BALF中 IL-4、IL-5、IL-8、TNF-a 较低 ,而模型组 BALF中 IL-4、IL-5、IL-8、TNF-α明显增加,说明模型大鼠气道存在明显的炎症反应,释放大量的细胞因子,参与了气道高反应。宣肺止嗽汤治疗组及惠菲宁组与模型组比较,治疗后其 IL-4、IL-5、IL-8、TNF-α水平均明显降低(P<0.01),与空白组比较水平相当(P>0.05),说明宣肺止嗽汤及惠菲宁均可抑制炎症介质的释放,且两者作用相似,其中宣肺止嗽汤的治疗效果与药物剂量无特殊关联,但通过测定各组细胞因子平均水平值,宣肺止嗽汤中、低剂量的疗效比高剂量组、惠菲宁对照组略好。本实验说明宣肺止嗽汤可能通过抑制炎症细胞释放细胞因子,减轻气道炎症,降低气道高反应,从而有效的治疗感染后咳嗽,这为宣肺止嗽汤的临床应用提供了客观的实验依据。

[1]黄秋芳.小儿感染后咳嗽的发病机理及治疗进展[J].中国药业,2009,18(15):84-87.

[2]林学颜,张玲.现代细胞与分子免疫学[M].北京:科学出版社,1999:191.

[3]李明华,殷凯生.哮喘病学[M].北京:人民卫生出版社,1998:79-83.

[4]张慎峰.气道高反应性的研究进展[J].黑龙江医学,2003,27(10):749-750.