金属硫蛋白3对快速老化痴呆小鼠海马胶原纤维酸性蛋白表达的影响

马飞煜 蔡君贤 陈晓燕 田贤先

(汕头市中心医院暨中山大学附属汕头医院神经内科，广东 汕头 515041)

阿尔茨海默病(AD)发病前提是脑的衰老，在脑衰老过程中，星形胶质细胞在形态和代谢方式上均发生很多变化，从而加重神经元损伤，导致神经功下降。胶原纤维酸性蛋白(GFAP)是一种仅存在于星形胶质细胞的胶原纤维中间丝，是该种细胞的特异性标记物〔1〕。GFAP变化可以反映星形胶质细胞的形态变化。快速老化痴呆模型小鼠SAMP8是目前公认的比较理想的自然衰老痴呆模型〔2～5〕，主要以学习记忆能力障碍为老化特征，其寿命约为12.1个月。SAMR1作为SAMP8的正常对照，表现为正常衰老。金属硫蛋白3(MT3)只在中枢神经系统特异表达，具有特定条件下发挥生长抑制因子、调节微量金属元素代谢、清除自由基等作用〔6〕。相关研究发现AD患者脑中MT3含量明显减少〔7〕，而GFAP表达增加，本实验研究二者之间表达是否有关联，采用SAMP8小鼠为痴呆模型，检测外源性MT3作用于SAMP8小鼠后海马结构GFAP的表达变化。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂及仪器 一抗(兔抗鼠GFAP多克隆抗体)，二抗(生物素化羊抗兔 IgG/Biotin)由Santa Cruz公司提供。MT3由北京大学生命科学院蛋白质工程实验室惠赠。Image-pro plus图像分析系统。

1.2 实验动物分组 SAMR1小鼠作为正常组。将SAMP8小鼠(7月龄)随机法分成5组:痴呆组、对照组(生理盐水，0.2 ml/10 g)、低、中、高浓度 MT3 组(75、150、300 μg/ml)。每组10只。由天津中医学院第一附属医院实验动物中心提供。连续28 d腹腔注射给药，停药1 d后进行实验。

1.3 免疫组化法染色海马GFAP阳性细胞 各组小鼠用4%多聚甲醛灌注取脑，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明后，浸蜡，石蜡包埋制成蜡块。海马区石蜡切片，脱蜡和脱水。1%H2O2灭活内源性过氧化物酶。枸橼酸盐缓冲液修复抗原，正常山羊血清封闭非特异性抗原。滴加一抗、二抗，滴加Streptavidin-HRP溶液。DAB显色，苏木精复染，中性树脂封片。对照用PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 免疫印迹法检测海马GFAP水平 小鼠处死后，取海马组织置于4℃预冷的组织裂解缓冲液中匀浆，12 000 r/min离心后取上清。用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳后将凝胶中的蛋白转移到PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h。加一抗(1∶1 000)4℃ 过夜。PBST洗膜4次，每次7 min。加二抗(1∶3 000)室温1 h，PBST洗膜4次，每次7 min。最后用超敏发光液化学发光、显影、定影。

1.5 图像分析及统计学分析 应用Image-pro-plus图像分析系统进行免疫组化图片光密度(IOD)值分析。Image-J分析软件对免疫印迹结果进行灰度定量分析。数据以±s表示，用SPSS10.0统计软件进行多组间方差检验和两组间t检验。

2 结果

2.1 各组小鼠海马结构GFAP的表达 GFAP阳性的星形胶质细胞形态如蜘蛛状，周围有放射状突起，突起相互交织成网，并伸入到锥体细胞及颗粒细胞层神经元间，胞质呈红棕色。痴呆组海马结构内可见大量浓染的GFAP阳性星形胶质细胞，体积肥大，突起密集、粗长，胞质和突起着色较深。正常组海马结构内的GFAP阳性星形胶质细胞较少，细胞体积较小，突起短细，胞质和突起着色较浅。痴呆组〔(20.59±1.96)×106〕和正常组〔(12.49±1.43)×106〕组间GFAP阳性星形胶质细胞的IOD值差异有统计学意义(P＜0.01)。随着给予MT3浓度的增加，痴呆组海马结构内的GFAP阳性星形胶质细胞减少，突起短细，细胞体积较小，着色较浅。高浓度MT3组的GFAP阳性细胞最少，IOD值差异有统计学意义(P＜0.05)。高浓度MT3组〔(13.58±1.61)×106〕与正常组比较，IOD值稍多，差异无统计学意义。高浓度MT3组、中浓度MT3组〔(15.49±1.62)×106〕较对照组〔(19.56±1.45)×106〕明显降低(P ＜0.05)，低浓度MT3组为〔(17.94±1.54)×106〕。说明MT3有抑制星形胶质细胞生长，体现出生长抑制的作用。

2.2 各组小鼠海马结构GFAP的表达 与正常组相比，痴呆组小鼠海马GFAP含量增加90%(P＜0.01)。3种浓度MT3处理后的痴呆组小鼠海马结构的GFAP表达量均下降，高浓度组下降40%左右。与对照组相比差异显著(P＜0.05)。见图1。

图1 各组小鼠海马GFAP表达的Western印迹结果

3 讨论

星形胶质细胞在神经元发育、突触传递、神经组织的修复和再生起着十分重要的作用，神经元的活动也影响星形胶质细胞的功能。星形胶质细胞含有一种特异性标记物——GFAP，它是一种仅存在于该细胞的胶原纤维中间丝蛋白。GFAP表达量的增加反映了星形胶质细胞的增生和活化。当各种原因导致星形胶质细胞肿胀时，其突起增多，延长，GFAP表达明显增多。过度活化的星形胶质细胞可以释放肿瘤坏死因子(TNF)、白介素、干扰素等有害因子导致迟发性神经元死亡;一氧化氮、细胞因子IL-6、载脂蛋白J(SP40)、α2-巨球蛋白、集落刺激因子如粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)等亦会损害神经末梢，导致斑块炎症改变和神经元纤维缠结(NFT)的形成，加速受损神经元的凋亡和导致痴呆〔8，9〕。本实验结果说明SAMP8小鼠较SAMR1小鼠海马结构星形胶质细胞的GFAP的过度表达，可能是导致痴呆的重要因素之一。

MT3于1991年首次被发现，它只在中枢神经系统特异表达。MT3具有特定条件下发挥生长抑制因子、清除自由基、调节微量金属元素代谢等作用。MT3的生长抑制功能最早是基于MT3在AD脑提取物的存在下对培养的神经元细胞生长具有抑制作用，因而最初将其命名为生长抑制因子〔10〕。本实验说明MT3有减少GFAP的表达，抑制星形胶质细胞活化的作用，间接起到神经元的保护作用，从而对AD有一定治疗作用。

1 Ahlemeyer B，Kehr K，Richter E，et al.Phenotype，differentiation，and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions〔J〕.J Neurosci Methods，2013;212(1):156-64.

2 Okuma Y，Nomura Y.Senescence-accelerated mouse(SAM)as an animal model of senile dementia:pharmacological，neurochemical and molecular biological approach〔J〕.Jpn J Pharmacol，1998;78:399-404.

3 Nomura Y，Okuma Y.Age-related defect s in lifespan and learning ability in SAMP8 mice〔J〕.Neurobiol Aging，1999;20:111-5.

4 Han S，Rudd JA，Hu ZY，et al.Analysis of neuronal nitric oxide synthase expression and increasing astrogliosis in the brain of senescence-accelerated-prone 8 mice〔J〕.Int J Neurosci，2010;120(9):602-8.

5 Fernández-Gómez FJ，Mu˜noz-Delgado E，Montenegro MF，et al.Cholinesterase activity in brain of senescence-accelerated-resistant mouse SAMR1 and its variation in brain of senescence-accelerated-prone mouse SAMP8〔J〕.J Neurosci Res，2010;88(1):155-66.

6 Manso Y，Carrasco J，Comes G，et al.Characterization of the role of metallothionein-3 in an animal model of Alzheimer's disease〔J〕.Cell Mol Life Sci，2012;69(21):3683-700.

7 Yu WH，Lukiw WJ，Bergeron C，et al.Metallothionein is reduced in Alzheimer's disease〔J〕.Brain Res，2001;894:37-45.

8 Webb P，Nguyen P，Valentine C，et al.The estrogen receptor enhances AP-1 activity by two distinct mechanisms with different requirements for recept or transactivation functions〔J〕.Mol Endocrinol，1999;13(10):1672-1685(Suppl 2):S4-8.

9 Rohn TT，Catlin LW，Poon WW.Caspase-cleaved glial fibrillary acidic protein within cerebellar white matter of the Alzheimer's disease brain〔J〕.Int J Clin Exp Pathol，2013;6(1):41-8.

10 Uchida Y，Ihara Y.The N-terminal portion of growth inhibitory factor is sufficient for biological activity〔J〕.J Biol Chem，1995;270(7):3365-9.