参附注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠GLUT1和GLUT3的影响

江承平，王柏强，刘福，李毅，杨明，周玥，吴碧华 （.川北医学院附属医院药剂科，四川 南充 637007；.川北医学院神经病学研究所，四川 南充 637000）

参附注射液主要是由中药人参、附片提取物组成，其主要有效成分分别是人参皂苷和乌头类生物碱［1］，近年来大量研究表明，参附注射液对于脑缺血再灌注损伤有着明显的疗效，目前对其保护机制尚不完全明确。本试验通过观察参附注射液对脑缺血再灌注损伤后大鼠缺血半影区葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）及葡萄糖转运蛋白3（GLUT3）表达的影响，探讨其在脑缺血再灌注损伤的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 PCR扩增仪（型号：PTC－150，MJ Research）；BDF－1600型双稳电泳仪（北京东方仪器公司）；蛋白转膜电泳槽及电泳仪（美国BIO－RAD公司）。参附注射液（雅安三九药业，10mL／支，批号 991202）；Trizol试剂（GIBOC公司）；RT－PCR试剂盒（Promega公司）；内参照GAPDH 及GLUT1和GLUT3引物由广州锐博生物公司合成；兔抗大鼠GLUT1和GLUT3抗体（一抗）购自Chemicon公司；羊抗兔抗体（二抗）购自北京中杉金桥公司；2，3，5－氯化三苯基四氮唑（TTC）购自Amresco公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型建立 健康雄性成年SD大鼠60只［SCXK（川2008－18）］，体质量210～250g（清洁级）由川北医学院实验动物中心提供。将大鼠分为4组：正常对照组（control组）、假手术组（sham组）、脑缺血再灌注组（IR组）、参附治疗组（SFI组），每组15只。模型建立方法参照本实验组前期试验［2］，SFI组于手术前7 d每天经静脉给参附注射液8 mg·kg－1，IR组与假手术组于手术前7天每天经静脉给予生理盐水（8 mg·kg－1），术前1 h完成最后一次注射，对照组不给予任何干预。所有大鼠于术前12 h给予禁食不禁水。采用线栓法经左侧颈外－颈内动脉插线建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，腹腔注射麻醉后分离颈部各动脉，电凝切断颈外动脉分支，将直径0.25 mm线栓自右颈外动脉插入颈内动脉，至遇阻力为止，深度约为18 mm（自颈总动脉分叉处算起）结扎固定栓线，术中保存直肠温度36.5～37.5℃。缺血2 h后，将尼龙线栓退至颈外动脉残端恢复大脑中动脉血供，再灌注24 h，以大鼠苏醒后出现左侧Horner征，爬行向左侧划圈或左前肢屈曲作为模型建成的标志。对照组不给予任何操作，假手术组只进行麻醉与血管分离术，不进行缺血再灌注。

1.2.2 脑梗死面积测定 方法参照本试验组前期试验［2］，各组动物实验结束，迅速断头取脑，置于－20℃冰箱中冷冻20min，距额极后2.5 mm，冠状面切取脑片5张，将切片迅速置于2%TTC溶液中，避光，37℃ 温孵15～30min，不时翻动脑片，使脑片均匀接触染色剂，正常脑组织呈玫瑰红色，梗死组织呈白色。然后置于4%多聚甲醛中固定，将染色结果输入计算机，利用图像处理软件（Auto CAD），分别计算出5个脑片缺血侧的总面积与梗死区域的面积，求出梗死区域占大脑半球总面积的百分比统计。

1.2.3 半定量逆转录－聚合酶链反应 缺血侧大脑半球矢状裂至外侧裂区域下2／3的皮质由于该区皮质仅由大脑中动脉供血，缺血较重，梗塞出现早且完全，代表缺血中心区；上1／3区域的皮质由于由大脑前动脉和大脑中动脉双重供血，该区域缺血相对较轻，代表缺血半影区。取缺血半影区皮层，Trizol试剂提取总RNA，GLUT1引物序列为：上游引物序列：5’– GCCTGAGACCAGTTGAAAGCAC –3’，下游引物序列：5’–CTGCTTAGGTAAAGTTACAGGAG–3’，预扩增片断为292Bp；GLUT3引物序列为：上游引物序列：5’– ATGATAGGCCTGGGAGGCAT–3’，下游引物序列：5’– TCGAAAGTCCTGCCTTTGGT–3’，预扩增片断为370Bp。β－actin引物序列为：上游引物序列：5’–TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG－3’，下游引物序列：5’－TTTGATGTCACGCACGATTTCC－3’， 预扩增片断为514Bp。循环条件：94℃变性1 min，56℃退火40s，72 ℃延伸30s，30个循环后，72 ℃再延伸10min，产物琼脂糖凝胶电泳，照像，Kodark 1D电泳成像系统扫描分析。

1.2.4 蛋白印迹 取缺血半影区皮层少量组织置于1.5 mL的Ep管中，剪碎，匀浆器匀浆，加入裂解液，离心吸取上清液，测定蛋白质浓度采用Bradford法。各标本取等量蛋白质50μg，上样，SDS－PAGE分离样品，转膜，封闭液室温封闭后分别加入一抗与二抗，加入ECL试剂，暗室曝光，显影，定影。以βactin为内参照，Kodark 1D电泳成像系统进行定量扫描分析，结果以β－actin校正。

1.3 统计学分析 实验数据均经SPSS17.0统计软件完成，结果以表示，正态性检验采用矩法，组间比较采用方差分析，方差不齐者采用非参数Kruskal Wallis检验，各组间两两比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 参附注射液对脑缺血再灌注大鼠脑梗死面积比的影响 TTC染色结果显示，对照组和假手术组大鼠脑片均红染，无白色梗死灶；IR组可见有明显的梗死灶；SFI组与IR组比较脑梗死比显著下降（P＜0.05），见表1。

2.2 GLUT1 mRNA和 GLUT3 mRNA检测结果RT－PCR结果显示，对照组和假手术组大鼠脑缺血半影区GLUT1 mRNA和GLUT3 mRNA表达水平明显低于IR组和SFI组（P＜0.05）；SFI组明显高于IR组（P＜0.05）；对照组和假手术组之间差异无统计学意义（P≥0.05），见图1、表1。

2.3 GLUT1和GLUT3蛋白检测结果 Western blots结果显示，对照组和假手术组大鼠脑缺血半影区GLUT1和GLUT3蛋白的表达水平的明显低于IR组和SFI组（P＜0.05）；SFI组明显高于IR组（P＜0.05）；对照组和假手术组之间差异无统计学意义（P≥0.05），见图2、表1。

表1 各组大鼠脑梗死面积比及半影区GLUT1、GLUT3 mRNA及蛋白的表达水平Tab 1 Infarction area ratio and expression of GLUT1 and GLUT3 in ischemia penumbra area

图1 GLUT1和GLUT3 mRNA的表达M.Marker；A.对照组；B.假手术组；C.IR组；D.SFI组Fig 1 Expression of GLUT1 and GLUT3 mRNAM.Marker；A.control group；B.sham－operated group；C.IR group；D.SFI group

图2 GLUT1和GLUT3蛋白的表达Fig 2 Expression of GLUT1 and GLUT3 protein

3 讨论

生理状态下，大脑不能储备碳水化合物，脑功能维持所需要的能量几乎完全依赖于不断从血液中得到稳定的葡萄糖供应而产生的ATP，因此，将葡萄糖转运至脑内的GLUT便成为维持脑代谢的重要物质。迄今为止，在哺乳动物的细胞中共发现13种GLUT。在脑内负责转运葡萄糖的转运蛋白主要是GLUT1和GLUT3［3］。GLUT1主要功能是将葡萄糖通过血脑屏障转运到脑内［4］，GLUT3主要负责将葡萄糖穿过神经元细胞的胞膜进入细胞内［5］。

1994年 Hossmann［6］将缺血半暗区定义为：能量代谢保存但是血供受到抑制的区域，其主要位于缺血中心区的周围。在我们的实验动物模型中，缺血侧大脑半球距离嗅球尖端7～11mm、矢状裂至外侧裂区域下2／3的皮质区域，由于此区域仅由大脑中动脉供血，梗死出现早并且完全，可以代表缺血中心区，上1／3的皮质区域由于由大脑前动脉和大脑中动脉双重供血，缺血较轻，可代表半暗区。缺血半暗区的组织，具有双向改变的可能，既可能通过改善脑血流量使半暗区的功能恢复，也可能由于脑血流量得不到改善进一步而发展为坏死。因此脑缺血的治疗重点是可逆恢复缺血的脑组织［7］。脑缺血时，血脑屏障的通透性发生改变，葡萄糖的代谢需求增加［8－10］，GLUT的表达也发生了变化。Vannucci等［11］在研究幼鼠脑缺血缺氧模型中发现缺血后GLUT1mRNA 的表达明显增加。Lee等［12］在实验中发现，大鼠脑缺血再灌注后缺血半区GLUT3 mRNA表达迅速提高。我们在试验中也得到相同的结果：大鼠脑缺血再灌注后缺血半暗区GLUT1和GLUT3 mRNA及蛋白水平明显升高，这可能是机体对缺血缺氧的代偿性保护机制，从而保证在缺血的状态下有足够的葡萄糖进入脑组织细胞从而维持正常细胞能量代谢减轻脑缺血损伤。

研究中我们还发现，参附注射液能够显著提高大鼠脑缺血再灌注损伤后GLUT1和GLUT3的表达，其具体机制尚不明确，GLUT1和GLUT3表达的增加，加快了葡萄糖通过血脑屏障向神经细胞的转运，增加了神经元细胞的能量供应，通过对脑缺血再灌注后脑代谢的改善起到减轻脑缺血再灌注损伤的作用，这可能是参附注射液抗脑缺血再灌注损伤的作用机制之一。由于复方中药制剂的作用机制复杂，参附注射液抗缺血再灌注损伤的作用可能还存在许多其他复杂的机制，还有待我们在以后进一步的研究和探讨。

［1］王伟，王军，徐艳，等.缺血缺氧性新生大鼠皮层神经元胞浆Smac／Diablo、caspase－9的表达及参附注射液的干预作用［J］.中华神经医学杂志，2011，10（3）：228－231.

［2］江承平，刘福，李毅，等.参附注射液对脑缺血再灌注大鼠MDA、SOD、TXB＿2及6－keto－PGF1a的影响及意义［J］.中国医科大学学报，2012，41（2）：124－127.

［3］Wood IS，Trayhurn P.Glucose transporters（GLUT and SGLT）：expanded families of sugar transport proteins［J］.Br J Nutr，2003，89（1）：3－9.

［4］王亮，唐文渊，孙晓川，等.创伤性脑损伤急性期高血糖对葡萄糖转运蛋白1表达的影响［J］.中国神经精神疾病杂志，2010，36（1）：30－33.

［5］王亮，陈亮，杨刚，等.创伤性脑损伤后高血糖对脑神经元损害作用的研究［J］.重庆医科大学学报，2010，35（9）：1327－1331.

［6］Hossmann KA.Viability thresholds and the penumbra of focal ischemia［J］.Ann Neurol，1994，36（4）：557－565.

［7］王锐，李涣英，王卫.白细胞介素1受体拮抗剂对大鼠局灶性脑缺血再灌注神经细胞凋亡的影响［J］.实用医学杂志，2008，24（19）：3316－3317.

［8］Vemula S，Roder KE，Yang T，et al.A functional role for sodium dependent glucose transport across the blood－brain barrier during oxygen glucose deprivation［J］.J Pharmacol Exp Ther，2009，328（2）：487－495.

［9］董文鹏，章翔，高大宽，等.白藜芦醇对小鼠局灶性缺血／再灌注后急性期的影响［J］.中国药理学通报，2008，24（8）：1032－1034.

［10］雷军荣，秦军，张晶姜，等.黄素对大鼠缺血性脑损伤炎症反应和血脑屏障通透性的影响［J］.中国药理学通报，2010，26（1）：120－124.

［11］Vannucci SJ，Reinhart R，Maher F，et al.Alterations in GLUT1 and GLUT3 glueose transporter gene expression following unilateral hypoxia－ischemia in the immature rat brain［J］.Brain Res Dev Brain Res，1998，107（2）：255－264.

［12］Lee WH，Bondy CA.Ischemic injury induces brain glucose transporter gene expression［J］.Endocrinology，1993，133（6）：2540－2544.