蛋白水解酶联合自溶作用的南极磷虾多肽氨基酸分析

倪 玲，吴文惠，2，张 启，谢 晶，包 斌，2，*

（1.上海海洋大学食品学院，上海201306；2.上海海洋大学海洋科学研究院，上海201306）

南极磷虾（Euphausia superba）广泛分布于南极水域，2005～2006年计划捕捞南极磷虾产量为24.5万t[1-2]，作为一种新的海洋生物资源因其巨大的生物量和潜在的渔业价值（最新估计量为6.5～10亿t）受到国内外广泛关注。对于当前国内外传统优质蛋白资源日趋匮乏的现状，南极磷虾蛋白质作为优质蛋白资源，开发利用南极磷虾蛋白无疑是满足人类需求的重要途径[3-5]。南极磷虾具有独特的营养和质量属性，除了作为高价值饲料受到关注以外，在食品工业和营养强化剂领域也日益受到重视[3，6]。南极磷虾直接干燥获得的南极磷虾粉被认为含有优良的蛋白质、富含β-胡萝卜素、优质脂类、矿物质、甲壳素和壳聚糖成分等，具有很强的适口性，特别是南极磷虾粉中只含有极微量的二噁英、多氯联苯（Polychlorinated biphenyls，PCB）和重金属这一特征使其成为不可替代的饲料原料[7]。南极磷虾的营养成分分析表明[8-9]，肌肉中含有约78%的蛋白质，8%的脂肪，约27%的脂肪属于多不饱和脂肪酸。含有18种常见氨基酸，其中包括8种人体必需氨基酸（Essential aminoacid，EAA），氨基酸总量（Total amino acid，TAA）为57.21%，其中必需氨基酸含量为25.88%，其构成比例符合FAO/WHO的标准[2，8]，18种水解氨基酸中，谷氨酸含量最高10.90%，赖氨酸含量次之5.93%，其余含量较高的还有丙氨酸、亮氨酸。色氨酸含量最低，只占氨基酸总量的1.38%。本文研究了伴随自溶作用的木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶水解南极磷虾肌肉的特性，以期获得氨基酸构成比例不同的富含营养价值的南极磷虾多肽（Antarctic Krill Enzymen-Resoliution With Autolysis Peptide，AKERAP）。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南极磷虾（Antarctic Krill） 青岛福卡海洋生物科技有限公司提供；试剂 国产优级分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；蛋白酶 购自国药集团化学试剂有限公司；实验用水 二次蒸馏用水；

全自动氨基酸分析仪 日本Hitachi公司；2300KJELTEC凯氏定氮仪 丹麦FOSS；CR21G高速冷冻离心机 日本Hitachi；Tanon-4100凝胶成像系统 上海天能科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 正交实验设计 以酶解温度（25、37、49℃）、酶解时间（2、8、14h）和蛋白水解酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶）进行单因素实验。在单因素实验基础上进行正交实验优化条件。设计L9（33）正交实验。通过之前的单因素实验结果设计正交实验表，因素水平表见表1。

表1 正交实验表设计Table 1 Factors and levels in L9（33）orthogonal array design

通过匀浆制备的南极磷虾匀浆液，在加入木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶进行L9（33）实验过程中，伴随着南极磷虾组织细胞破裂其自溶酶如胰蛋白酶[13]的自溶作用。

1.2.2 AKERP的制备 准确称取冷冻南极磷虾20g置于1000mL烧杯中，加入磷酸盐缓冲液（50mmol/L）100mL匀浆，用6.0mol/L的NaOH或HCl溶液调至木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的最适pH分别是pH8.0、pH8.0和pH2.0，分别加入蛋白水解酶（胃蛋白酶占南极磷虾重的0.05%、胰蛋白酶占南极磷虾重的0.1%、木瓜蛋白酶占南极磷虾重的0.1%），在所需条件水解后于5000r/min离心10min，取上清液供测试分析。胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶活力分别是1200、5000、6000u/mg。

1.2.3 南极磷虾多肽含量（以粗蛋白的量计）的测定

参考自动凯氏定氮仪检测粗蛋白的方法[10]。各取5mL样品加入基尔特克250mL消化管中，分别加入硫酸15mL、硫酸钾5.0g、硫酸铜0.5g，在450℃下消化3h，冷却，用自动凯氏定氮仪测总的含氮量，根据氮换算为蛋白质的平均系数6.25计算得出粗蛋白的量。

1.2.4 SDS-PAG电泳 参考SDS-PAGE方法对1.2.3所得上清液进行电泳[11]，分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为3%，电极缓冲液为SDS-Tris-甘氨酸，电泳电流25mA，电压600V，电泳时间为1.5～2h.计算酶解多肽的分子量，并用凝胶成像仪分析不同分子量的酶解多肽的相对百分含量。

1.2.5 氨基酸分析 采用氨基酸分析方法[12]，精确量取样品1mL（1mg/mL），转入置于100℃水浴10mL的水解管中，加入温度为100℃的7.5mol/L的优级纯盐酸4mL，迅速旋紧试管盖。然后将试管放在110℃的干热箱中保温24h。取出试管冷却至室温，用6mol/L的NaOH中和至中性，过滤，滤液用去离子水加至20mL（作为a液）。取a液400μL用0.02mol/L的优级纯盐酸稀释到2000μL，此时样品终浓度约为2nmol/20μL。经0.54nm滤膜过滤得到氨基酸分析用样品，用氨基酸分析仪测定氨基酸组成，分析各样品的氨基酸含量。在碱解条件下测定了色氨酸的含量。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 酶解温度的优化 选取胰蛋白酶，酶解温度分别为25、37、49℃酶解南极磷虾，测定其多肽含量。从图1中可以分析得出，酶解的温度在37℃时，南极磷虾的多肽量达到最大，明显高于其他两个酶解温度的多肽量。

图1 温度对南极磷虾多肽量的影响Fig.1 Effect of different temperature of Hydrolysis on the content of Antarctic krill Peptide

2.1.2 酶解时间的优化 选取胰蛋白酶，酶解时间分别为2、8、14h，测定酶解时间对南极磷虾多肽量的影响。从图中可以得出酶解的最佳时间为8h。

图2 酶解时间对南极磷虾多肽量的影响Fig.2 Effect of different time of Hydrolysis on the content of Antarctic krill Peptide

2.1.3 蛋白水解酶的选择 选取胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶在37℃条件下酶解8h，结果如图3所示。结果表明胰蛋白酶对南极磷虾的酶解得到的南极磷虾多肽含量最高，明显优于木瓜蛋白酶和胃蛋白酶。由于三种蛋白酶的作用位点不同，酶解产生的多肽分子量也就不同，综上，正交实验选择了三种蛋白酶设计实验。

图3 酶的种类对南极磷虾多肽量的影响Fig.3 Effect of different enzyme of Hydrolysis on the content of Antarctic krill Peptide

2.2 不同处理条件对南极磷虾多肽含量的影响结果

使用凯氏定氮仪，按照1.2.3的方法，对正交实验的9个样品（表2）利用凯式定氮仪测定粗蛋白量，以南极磷虾多肽的含量为评价指标，结果如表2和图4所示。

表2 正交实验结果Table 2 Results of orthogonal experiment for L9（33）

从表2可以看到，处理样品的南极磷虾多肽（以粗蛋白含量计）浓度在15.21～21.79mg/mL的范围。蛋白水解酶处理的极差最大，温度处理的极差最小，影响粗蛋白含量的3个因素的重要性依次为A＞B＞C。最佳组合为A2B3C3。即：使用胰蛋白酶，培养温度45℃，水解12h。

以表2为基础，进行了蛋白水解酶、处理时间、处理温度对南极磷虾多肽含量影响的方差分析。通过方差分析可得，蛋白水解酶因素对南极磷虾多肽数量的影响最大。

在南极磷虾多肽制备过程中匀浆液的固体数量逐渐减少，在不同正交实验处理条件下酶解多肽液的颜色和气味不同，其中实验号7（A3B1C3）、8（A3B2C1）、9（A3B3C2）的颜色较深，初步认为在45℃比较适宜的酶作用温度下存在于肌组织蛋白质中的虾青素因蛋白质酶解而被释放出来，在本实验的条件下虾青素从无色转变为褐色而使各酶解液呈现出程度不同的褐色，特别是被木瓜蛋白酶处理的样品水解程度较大。

在加热和酶解的条件下，南极磷虾中的呈味小分子化合物（可能是琥珀酸或乳酸）被释放出来[14-16]，呈现南极磷虾特有的气味。正交实验处理样品的多肽含量与其他学者的研究结论相似[14]。

2.3 电泳分析

将上述正交实验样品进行电泳，用凝胶成像仪分析正交实验9个样品中不同分子量的酶解多肽（图4），每条多肽条带占整条泳带的相对百分含量如表3所示。

图4 南极磷虾多肽的SDS-PAGEFig.4 Enzymatic Hydrolysate electrophoresis of Antarctic krill hydrolyzate

图5 标准蛋白质的迁移率和分子量的线性关系Fig.5 Linear relation on molecular weight related mobility of marker

从图4可以看到，正交实验处理样品的南极磷虾多肽种类不同，用胰蛋白酶处理的样品南极磷虾多肽种类（条带）最多，胃蛋白酶处理的样品次之，木瓜蛋白酶处理的样品最少。从条带的深浅上也体现出胰蛋白酶处理的样品深于胃蛋白酶、胃蛋白酶处理的样品，这说明胰蛋白酶处理的样品含有的南极磷虾多肽的量较高。正交实验处理样品的南极磷虾多肽最多为18种（条带），其分子量分别为143.8（a）、110.9（b）、77.6（c）、68.3（d）、61.8（e）、57.9（f）、52.6（g）、49.3（h）、45.2（i）、40.5（j）、33.4（k）、30.7（l）、26.6（m）、22.6（n）、19.6（o）、16.3（p）、14.3（q）、11.1（r）ku。

由图4和表3可知，样品4（A2B1C2）、5（A2B2C3）、6（A2B3C1）的南极磷虾酶解液中的南极磷虾多肽的分子量在11.1～143.8ku较多，其中样品6最多，占整条泳带的57.60%，样品1（A1B1C1）、2（A1B2C2）、3（A1B3C3）次之，样品7（A3B1C3）、8（A3B2C1）、9（A3B3C2）中最少。在所有样品中分子量49.3ku以下的多肽分子占大部分，在样品5（A2B2C3）中分子量11.1～49.3ku的多肽分子约占多肽分子总量64.36%，同样，在样品6（A2B3C1）中占68.01%，这说明南极磷虾肌肉蛋白的胰蛋白酶酶解效果较好。但是在样品4 （A2B1C2）、5（A2B2C3）、6（A2B3C1）、7（A3B1C3）、8（A3B2C1）、9（A3B3C2）的泳带中，分子量较大的a条带较难水解，但在样品1（A1B1C1）、2（A1B2C2）、3（A1B3C3）中却没有出现，这可能与所加的酶有关，说明胃蛋白酶可水解分子量较大的a蛋白。SDS-PAGE和水解短肽的结果表明木瓜蛋白酶对南极磷虾肌肉蛋白的水解程度最大。

表3 南极磷虾多肽电泳条带的相对含量Table 3 Results of electrophoresis gel of the Antarctic krill hydrolyzate

2.4 氨基酸分析及营养价值评价

由于不同的蛋白酶水解多肽含有的多肽种类不同。选取样品2（A1B2C2）、5（A2B2C3）、7（A3B1C3）、9（A3B3C2）及优化组合A2B3C3五个样品，分析了AKERP的常见氨基酸的种类和数量，其中2（A1B2C2）、5（A2B2C3）、7（A3B1C3）、9（A3B3C2）代表三种不同蛋白水解酶水解南极磷虾得到多肽含量较高的样品，优化组合A2B3C3为最佳酶解条件下获得的南极磷虾多肽酶解液。结果如表4和图6所示。

由表4可知，南极磷虾酶解氨基酸共测得18种常见氨基酸，其中包括8种人体必需氨基酸（Essential amino acid，EAA）；10种非必需氨基酸（Nonessential amino acid，NEAA）。氨基酸数量（Total amino acid，TAA）最高的是最优酶解条件下（A2B3C3）获得的南极磷虾酶解多肽溶液样品。南极磷虾多肽中含量最高的氨基酸是谷氨酸，其次是甘氨酸、天冬氨酸和丙氨酸。

不同处理条件下，胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸的数量变化比较大，其他氨基酸在不同处理间变化较小。具有广泛酶切位点的木瓜蛋白酶、胃蛋白酶与作用位点在赖氨酸和精氨酸之间的胰蛋白酶相比，在自溶作用存在的条件下，南极磷虾多肽的氨基酸组成没有规律性。

图6 南极磷虾多肽的氨基酸模式图Fig.6 Amino acid patternof polypeptide from Antarctic krill

根据FAO/WHO推荐的理想蛋白质模式认为，质量较好的蛋白质其氨基酸组成EAA/TAA在40左右，EAA/NEAA在60以上。由图6得知，样品A1B2C2、A2B2C3、A3B1C3、A2B3C3、A3B3C2的南极磷虾多肽的EAA/TAA分别为为39、40、40、41和40，EAA/NEAA分别为为64、67、65、68和68，该结果表明南极磷虾多肽不仅含有丰富的必需氨基酸，而且必需氨基酸之间的比例适宜，有利于人体吸收。

3 结论与讨论

南极磷虾作为海洋优质蛋白资源，其高值化利用和规模化加工都有待进行深入探索和研究，南极磷虾肌肉蛋白的应用生物化学特性、南极磷虾蛋白的分离方法和利用途径以及南极磷虾蛋白的食用安全性都是南极磷虾利用过程中亟待解决的理论问题和实际问题[17-18]，本文针对南极磷虾的利用从磷虾肌肉蛋白水解的角度进行了有益的探索。

表4 南极磷虾多肽样品的氨基酸分析表Table 4 Comparison of amino acids in enzymatic hydrolysate of Euphausia superba

正交实验以水解固形物、南极磷虾多肽、氨基酸特征为指标，通过正交实验得出蛋白水解酶联合自溶作用水解南极磷虾肌肉蛋白的最佳条件为使用胰蛋白酶在温度45℃的条件下水解12h，获得的AKERP的分子量为11.1～49.3ku的南极磷虾多肽所占比例较大。南极磷虾多肽富含18种常见氨基酸，8种必需氨基酸种类齐全，EAA/TAA和EAA/NEAA分别在40以上和64以上，符合FAO/WHO推荐的理想蛋白质模式，蛋白质营养价值较高，是一种优质蛋白质。

低温冻藏（-80℃）的南极磷虾在解冻过程中由于细胞内外冰晶的机械损伤，细胞膜结构受到破坏，存在于细胞间质的金属蛋白酶（如dispase）和细胞内外的丝氨酸蛋白酶（如蛋白酶K、胰蛋白酶等）作用于肌肉组织中的肌球蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白和肌钙蛋白[19]，特别是在解冻升至室温在经历0～3℃的过程中南极磷虾迅速自溶[15]，如果这个阶段经历的时间足够长，这种自溶作用带来的蛋白质降解最高可以达到20%以上，在继续添加外来的蛋白质水解酶如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶并在该酶的最适pH条件下，大部分自溶作用酶被抑制，南极磷虾肌肉组织中的肌球蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白和肌钙蛋白被外源蛋白水解酶继续水解，从正交实验处理的南极磷虾多肽氨基酸构成没有较大差别的结果分析，加入足够酶活力数量单位的蛋白水解酶如木瓜蛋白酶（加入样品中的酶活力单位为120000u）、胃蛋白酶（加入样品中的酶活力单位为12u）和胰蛋白酶（加入样品中的酶活力单位为1000u）都能够使样品完全水解，具有广泛酶作用位点的木瓜蛋白酶和胃蛋白酶使南极磷虾肌肉迅速水解，作用于精氨酸和赖氨酸肽键的胰蛋白酶水解南极磷虾肌肉相对较慢。这些结论能被SDS-PAGE和氨基酸分析结果所证明。

本文通过南极磷虾的自溶作用[23-24]继以蛋白酶水解得到了分子量较小的南极磷虾多肽，这为南极磷虾的高效利用奠定了理论基础。木瓜蛋白酶水解南极磷虾获得多肽量较高，但电泳条带占泳带百分量较低，初步推测是因为木瓜蛋白酶水解获得的多肽分子量低于11.1ku，在电泳的过程中，没有被留在电泳凝胶上，这一推测有待进一步验证。

[1]黄洪亮，陈雪忠，冯春雷.南极磷虾资源开发现状分析[J].渔业现代化，2007，34（1）：48-51.

[2]Kunio T，Takahashi，Kawaguchi S，et al.Parasitic eugregarines change their spatial distribution within the host digestive tract of Antarctic krill，Euphausia superba[J].Polar Biol，2003，26：468-473.

[3]徐吟梅，邱卫华，余丽萍，等.南极磷虾粉的营养与功能[J].现代渔业信息，2010，25（8）：14-16.

[4]陈雪忠，徐兆礼，黄洪亮.南极磷虾资源利用现状与中国的开发策略分析[J].中国水产科学，2009，16（3）：451-458.

[5]黄洪亮，陈雪忠.南极磷虾资源开发利用现状及发展趋势[J].中国水产科学，2004（21）：114-119.

[6]Amakasu K，Atsushi O，Masato M，et al.Sexual dimorphism in body shape of Antarctic krill（Euphausia superba） and its influence on target strength[J].Polar Science，2011，5（2）：187-194.

[7]Rubén OB，Claudio RR，Michael GH.Purification of trypsinlike enzymes from Antarctic krill processing wastewater[J].Original Research Article Process Biochemistry，1999，35（11）：327-333.

[8]孙雷，周德庆，盛晓风.南极磷虾营养评价与安全性研究[J].海洋水产研究，2008，29（2）：57-64.

[9]Motono M.Chemistry offoods and beverages：recent developments[M].New york：Academic Press，1982：181-183.

[10]中华人民共和国国家标准.食物中蛋白质的测定方法[S].GB/T 5009.5-1985.

[11]刘国琴，吴玮，陈鹏.现代蛋白质实验技术[M].北京：中国农业大学出版社，2011：1-8.

[12]中华人民共和国国家标准.食物中氨基酸的测定方法[S].GB/T 14965-1994.

[13]Martin JC，Joseph DW，David AD，et al.Three-dimensional observations of swarms of Antarctic krill（Euphausia superba）made using a multi-beam echosounder[J].Deep Sea Research Part II：Topical Studies in Oceanography，2010，57（7/8）：508-518.

[14]Gigliotti JC，Jaczynski J，Tou JC.Determination of the nutritional value，protein quality and safety of krill protein concentrate isolated using an isoelectric solubilization/precipitation technique[J].Food Chemistry，2008，111（1）：209-214.

[15]伍彬，章超桦，吉宏武，等.南美白对虾虾头自溶产物主要呈味成分分析[J].食品科学，2010，31（10）：184-187.

[16]李学英，迟海，杨宪时，等.南极磷虾冷藏过程中的品质变化[J].食品科学，2010，31（20）：464-468.

[17]Eileen AF，Hofmann E，Murphy EJ.Transport of Antarctic krill（Euphausia superba） across the Scotia Sea[J].Part II：Krill Growth and Survival Deep Sea Research Part I：Ocean，2006，53：1011-1043.

[18]Nicol S，Foster J.Recent trends in the fishery for Antarctic krill[J].Aquatic Living Resources，2003，16（1）：42-45.

[19]Sjödahl J，Emmer 魡，Vincent J，et al.Characterization of proteinases from Antarctic krill（Euphausia superba）[J].Protein Expression and Purification，2002，26（1）：153-161.